ELISA实验—试剂盒实验操作|基本知识点
elisa实验—试剂盒实验基本知识点
基本类型:
酶联免疫吸附试验 (以下简称elisa) ：是酶免疫测定技术中应用的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体 ( 聚苯乙烯微量反应板 ) 表面，使酶标记的抗原-抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。常用的 elisa 法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体。
用途:
根据elisa所用的固相载体而区分为三大类型：一是采用聚苯乙烯微量板为载体的elisa，即我们通常所指的elisa(微量板elisa);另一类是用硝酸纤维膜为载体的elisa,称为斑点elisa(dot-elisa);再一类是采用疏水性聚脂布作为载体的elisa，称为布elisa(c-elisa)。在微量板elisa中，又根据其性质不同分为间接elisa、双抗体夹心elisa、双夹心elisa、竞争elisa、阻断elisa及抗体捕捉elisa。
操作程序:
1、间接elisa
本法主要用于检测抗体。以鸭病毒性肝炎(dvh)抗体的elisa为例，间接elisa的操作程序如下：
(1) 材料
① 包被液、洗涤液、保温液、底物液、终止液;
② dvh包被抗原、酶标抗抗体、阴性及阳性dvh参考血清;待检鸭血清;
③ elisa检测仪、加样器、聚苯乙烯微量板。
(2) 方法步骤
① 加抗原包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干
② 加待检血清 → 37℃ 2小时，洗涤三次、抛干
③ 加酶标抗体 → 37℃ 2小时，洗涤三次、抛干
④ 加底物液 → 37℃ 30分钟，加终止液
⑤ 用elisa检测仪测定od值，并计算出p/n比值。
(3) 结果判定 已知阳性血清与已知阴性血清的比值(p/n)≥2.1，而且已知阳性血清的od值≥0.4;在上述条件成立的情况下，如果待检血清与已知阴性血清的比值(p/n)≥2.1，而且待检血清的od值≥0.4，则判为阳性，否则判为阴性。
2、双抗体夹心elisa
本法主要用于检测大分子抗原。现以检测鸡传染性法氏囊病病毒(ibdv)的双夹心抗体elisa为例介绍本法的操作程序。
① 加抗体包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干
② 加待检抗原 → 37℃ 30分钟，洗涤三次、抛干
③ 加酶标抗体 → 37℃ 30分钟，洗涤三次、抛干
④ 加底物液 → 37℃ 15分钟，加终止液
⑤ 用elisa检测仪测定od值。
3、双夹心elisa
此法与双抗体夹心elisa的主要区别在于：它是采用酶标抗抗体检查多种大分子抗原，它不仅不必标记每一种抗体，还可提高试验的敏感性。
此法的基本程序为：
① 加抗体(ab-1)包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干
② 加待检抗原(ag) → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干
③ 加用非同种动物生产的特异性抗体(ab-2)→ 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干
④ 加入酶标抗ab-2抗体(ab-3)→ 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干
⑤ 加底物液 → 37℃ 20分钟，加终止液
⑥ 用elisa检测仪测定od值。
4、竞争elisa
此法主要用于测定小分子抗原及半抗原，其原理类似于放射免疫测定。
其基本程序为：
① 抗体包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干
② 加入待检抗原及一定量的酶标抗原(对照孔仅加酶标抗原)→ 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干
③ 加底物液 → 37℃ 20分钟，加终止液
④ 用elisa检测仪测定od值。
被结合的酶标抗原的量由酶催化底物反应产生有色产物的量来确定，如果待检溶液中抗原越多，被结合的标记抗原的量就越少，有色产物就减少，这样根据有色产物的变化就可求出未知抗原的量。此法的优点在于快速、特异性高、且可用于小分子抗原及半抗原的检测;其主要不足在于每种抗原都要进行酶标记，而且因为抗原的结构不同，还需应用不同的结合方法。此外，试验中应用酶标抗原的量较多。
5、阻断elisa
本法主要用于检测型特异性抗体。该方法现已成为猪传染性胃肠炎(tge)、猪伪狂犬病(pr)及猪胸膜肺炎(ap)的主要检测方法。
下面以ap2型抗体的阻断elisa检测法为例介绍其操作程序：
① 100μl ap2型工作量抗原包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干
② 用200μl阻断缓冲液进行封闭 → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干
③ 加工作量1:4稀释被检猪血清100μl → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干
④ 加100μl工作量兔抗ap2型血清 → 37℃ 30分钟，洗涤三次、抛干
⑤ 加100μl工作量猪抗兔igg-hrp → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干
⑥ 加100μl opd底物液 → 37℃ 20分钟，加终止液
⑦ 用elisa检测仪测定od值。
本试验同时设标准阴、阳性血清对照、兔抗ap2型阳性对照、空白对照。
elisa试剂盒 本生一直视质量控制为企业的生命，追求企业竞争力的不断提升。公司在经营中始终秉承：遵纪守法，严于律己，宽仁以待，敢于承担的企业精神作为标准，以过硬的质量和优良的服务来维护和拓展市场，较大限度的满足客户的需求。与客户的共赢，是我们的发展目标。本生!您信任的合作伙伴。我们愿与您真诚合作，共创美好的未来。
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基本类型:
酶联免疫吸附试验 (以下简称elisa) ：是酶免疫测定技术中应用的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体 ( 聚苯乙烯微量反应板 ) 表面，使酶标记的抗原-抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。常用的 elisa 法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体。
用途:
根据elisa所用的固相载体而区分为三大类型：一是采用聚苯乙烯微量板为载体的elisa，即我们通常所指的elisa(微量板elisa);另一类是用硝酸纤维膜为载体的elisa,称为斑点elisa(dot-elisa);再一类是采用疏水性聚脂布作为载体的elisa，称为布elisa(c-elisa)。在微量板elisa中，又根据其性质不同分为间接elisa、双抗体夹心elisa、双夹心elisa、竞争elisa、阻断elisa及抗体捕捉elisa。
操作程序:
1、间接elisa
本法主要用于检测抗体。以鸭病毒性肝炎(dvh)抗体的elisa为例，间接elisa的操作程序如下：
(1) 材料
① 包被液、洗涤液、保温液、底物液、终止液;
② dvh包被抗原、酶标抗抗体、阴性及阳性dvh参考血清;待检鸭血清;
③ elisa检测仪、加样器、聚苯乙烯微量板。
(2) 方法步骤
① 加抗原包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干
② 加待检血清 → 37℃ 2小时，洗涤三次、抛干
③ 加酶标抗体 → 37℃ 2小时，洗涤三次、抛干
④ 加底物液 → 37℃ 30分钟，加终止液
⑤ 用elisa检测仪测定od值，并计算出p/n比值。
(3) 结果判定 已知阳性血清与已知阴性血清的比值(p/n)≥2.1，而且已知阳性血清的od值≥0.4;在上述条件成立的情况下，如果待检血清与已知阴性血清的比值(p/n)≥2.1，而且待检血清的od值≥0.4，则判为阳性，否则判为阴性。
2、双抗体夹心elisa
本法主要用于检测大分子抗原。现以检测鸡传染性法氏囊病病毒(ibdv)的双夹心抗体elisa为例介绍本法的操作程序。
① 加抗体包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干
② 加待检抗原 → 37℃ 30分钟，洗涤三次、抛干
③ 加酶标抗体 → 37℃ 30分钟，洗涤三次、抛干
④ 加底物液 → 37℃ 15分钟，加终止液
⑤ 用elisa检测仪测定od值。
3、双夹心elisa
此法与双抗体夹心elisa的主要区别在于：它是采用酶标抗抗体检查多种大分子抗原，它不仅不必标记每一种抗体，还可提高试验的敏感性。
此法的基本程序为：
① 加抗体(ab-1)包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干
② 加待检抗原(ag) → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干
③ 加用非同种动物生产的特异性抗体(ab-2)→ 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干
④ 加入酶标抗ab-2抗体(ab-3)→ 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干
⑤ 加底物液 → 37℃ 20分钟，加终止液
⑥ 用elisa检测仪测定od值。
4、竞争elisa
此法主要用于测定小分子抗原及半抗原，其原理类似于放射免疫测定。
其基本程序为：
① 抗体包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干
② 加入待检抗原及一定量的酶标抗原(对照孔仅加酶标抗原)→ 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干
③ 加底物液 → 37℃ 20分钟，加终止液
④ 用elisa检测仪测定od值。
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5、阻断elisa
本法主要用于检测型特异性抗体。该方法现已成为猪传染性胃肠炎(tge)、猪伪狂犬病(pr)及猪胸膜肺炎(ap)的主要检测方法。
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① 100μl ap2型工作量抗原包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干
② 用200μl阻断缓冲液进行封闭 → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干
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