细胞培养操作流程
细胞培养（cell culture）是指在体外模拟体内环境（无菌、适宜温度、酸碱度和一定营养条件等），使之生存、生长、繁殖并维持主要结构和功能的一种方法。细胞培养也叫细胞克隆技术，在生物学中的正规名词为细胞培养技术。
一．培养基及培养冻存条件准备：
1、准备rpmi-1640培养基(rpmi-1640：gibco，货号21875-091)，90%；胎牛血清，10%。
2、培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。
3、冻存液：90%血清，10%dmso，现用现配，液氮储存。
二．细胞处理：
1、复苏细胞：将含有1ml细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于冻存管盖部）摇晃解冻，移入事先准备好的含有4ml培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000rpm条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1ml培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。
2、细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。对于悬浮细胞，传代可参考以下方法：
方法一：收集细胞，1000rpm，常温条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2ml培养液后吹匀，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
三、操作流程：
1、主要试剂与仪器：倒置相差显微镜（日本 olympus imt-413），co2孵箱（日本yamato it-61）。
2、 hek-293细胞的复苏培养传代及冻存：
2.1 、细胞的复苏培养 从液氮罐中取出冻存管,立即投入37℃水浴,并不断的摇动,使之迅速融化。 将溶解的细胞冻存管取出,用酒精消毒后打开,吸出溶有细胞的冻存液,加入事先装好培养液（37℃预热，8～10倍体积）离心管内,稍微吹打混匀,然后1000rpm 5min,去除上清,加入适量培养液,吹打成细胞悬液, 以1×105/ml密度接种于25cm2培养瓶内，在37℃、5％co2及饱和湿度下培养。
2.2、 细胞传代 原代培养的hek－293细胞48h换液1次，细胞长至60%～70%融合时，用0.25%yi酶消化1～2min，将培养瓶再用手掌轻轻敲打使细胞脱壁、悬浮、分散，为使细胞进一步分散可用吹打管轻轻吹打几次，获得细胞悬液，然后加入倍量的培养基，温和混匀，吸管分装混合液，传代扩增细胞。
3、 细胞形态的观察 在倒置显微镜下观察并记录细胞的生长情况及形态特征。
4、细胞的计数 常规消化细胞，待细胞变圆、脱壁并浮起，加入少量培养基离心，再用pbs重悬并吹打制成细胞悬液。在细胞计数板盖玻片的一侧加微量细胞悬液，用10×物镜观察计数板四角大方格细胞数，按公式计算出细胞数。细胞数/ml原液＝(四方格细胞数之和/4) ×104。
5、细胞的贴壁率 指数生长期的细胞，以0.25％yi酶消化成单细胞悬液，计数后分别接种于12个25cm2培养瓶中，每两小时随机取出3瓶细胞，吸除培养基及未贴壁细胞，加入胰消化酶消化、计数已贴壁细胞，取其平均值，按照公式：贴壁率(%)=(已贴壁细胞数/接种细胞数) =计算贴壁率。
6、 生长曲线 取指数生长期的细胞用yi酶消化制成单细胞悬液，以1×104/孔接种于24孔板，每孔加入1ml培养基。每天随机取3孔，计数每孔细胞的数目并计算平均值。连续计数10d，绘制细胞生长曲线。
关键词：培养箱 显微镜 倒置显微镜
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一．培养基及培养冻存条件准备：
1、准备rpmi-1640培养基(rpmi-1640：gibco，货号21875-091)，90%；胎牛血清，10%。
2、培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。
3、冻存液：90%血清，10%dmso，现用现配，液氮储存。
二．细胞处理：
1、复苏细胞：将含有1ml细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于冻存管盖部）摇晃解冻，移入事先准备好的含有4ml培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000rpm条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1ml培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。
2、细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。对于悬浮细胞，传代可参考以下方法：
方法一：收集细胞，1000rpm，常温条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2ml培养液后吹匀，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
三、操作流程：
1、主要试剂与仪器：倒置相差显微镜（日本 olympus imt-413），co2孵箱（日本yamato it-61）。
2、 hek-293细胞的复苏培养传代及冻存：
2.1 、细胞的复苏培养 从液氮罐中取出冻存管,立即投入37℃水浴,并不断的摇动,使之迅速融化。 将溶解的细胞冻存管取出,用酒精消毒后打开,吸出溶有细胞的冻存液,加入事先装好培养液（37℃预热，8～10倍体积）离心管内,稍微吹打混匀,然后1000rpm 5min,去除上清,加入适量培养液,吹打成细胞悬液, 以1×105/ml密度接种于25cm2培养瓶内，在37℃、5％co2及饱和湿度下培养。
2.2、 细胞传代 原代培养的hek－293细胞48h换液1次，细胞长至60%～70%融合时，用0.25%yi酶消化1～2min，将培养瓶再用手掌轻轻敲打使细胞脱壁、悬浮、分散，为使细胞进一步分散可用吹打管轻轻吹打几次，获得细胞悬液，然后加入倍量的培养基，温和混匀，吸管分装混合液，传代扩增细胞。
3、 细胞形态的观察 在倒置显微镜下观察并记录细胞的生长情况及形态特征。
4、细胞的计数 常规消化细胞，待细胞变圆、脱壁并浮起，加入少量培养基离心，再用pbs重悬并吹打制成细胞悬液。在细胞计数板盖玻片的一侧加微量细胞悬液，用10×物镜观察计数板四角大方格细胞数，按公式计算出细胞数。细胞数/ml原液＝(四方格细胞数之和/4) ×104。
5、细胞的贴壁率 指数生长期的细胞，以0.25％yi酶消化成单细胞悬液，计数后分别接种于12个25cm2培养瓶中，每两小时随机取出3瓶细胞，吸除培养基及未贴壁细胞，加入胰消化酶消化、计数已贴壁细胞，取其平均值，按照公式：贴壁率(%)=(已贴壁细胞数/接种细胞数) =计算贴壁率。
6、 生长曲线 取指数生长期的细胞用yi酶消化制成单细胞悬液，以1×104/孔接种于24孔板，每孔加入1ml培养基。每天随机取3孔，计数每孔细胞的数目并计算平均值。连续计数10d，绘制细胞生长曲线。
关键词：培养箱 显微镜 倒置显微镜
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