大肠杆菌重组蛋白表达系统常见5大问题解析
大肠杆菌（e.coli）重组蛋白表达技术经过多年的发展，相对于其他表达体系，算是非常成熟的一个体系。大肠杆菌蛋白表达系统主要有以下特点：遗传背景清楚；易于培养和控制；转化操作简单；表达水平高；成本低；周期短。本篇将对大肠杆菌重组蛋白表达系统的常见技术问题进行一一解答。
1：大肠杆菌表达体系的优点是什么？
（1）菌体繁殖速度快：20分钟倍增一次，这意味着按照1/100的比例接种（moi），只需要几个小时培养基细菌即可到达稳定期；
（2）容易实现高密度培养：理论培养密度是1×1013cells/ml，实际培养过程中使用lb培养基在37℃培养大肠杆菌，<1×1010cells/ml。在低温（11℃）诱导蛋白表达时，细菌个数几乎不增长。
（3）转染外源dna容易，质粒转染效率高。
2：去除蛋白标签的方法有哪些？
去除蛋白标签的方法分为两类，一类是酶消化法；一类是化学裂解法。化学裂解法通常被用于融合伴侣蛋白的移除，如cnbr用于裂解与met氨基酸c-端连接的多肽，该方法优点是价格便宜，缺点是蛋白序列中不能存在met氨基酸残基。酶消化法是目前常用的蛋白标签去除方法，如腸激脢（enterokinase），凝血酶（thrombin），factorxa和烟草蚀刻病毒蛋白酶(tevprotease)等移除蛋白标签，只残留少数几个氨基酸残基。带有his标签的tev蛋白酶逐渐被广泛接受用于蛋白标签移除实验，该蛋白酶具有一个非常优秀的特点:切除标签后，只残留一个ser或gly残基或不残留氨基酸残基。
3：什么是合适的蛋白表达宿主？
重组蛋白原核表达常采用bl21（de3）和k-12衍生菌株作为表达宿主。bl21菌株缺乏lon蛋白酶和外膜蛋白酶ompt，lon蛋白酶主要功能是降解外源蛋白，外膜蛋白酶ompt主要功能是降解胞外基质蛋白。同时bl21菌株具有先天性的hsdsb基因突变，菌株失去甲基化和降解外源转染质粒的能力，使得质粒能够传代保留至子代细菌中（hsdsb突变基因来源于父辈b834菌株）。k-12系列菌株具有两大优点：一个是能够促进胞质中蛋白二硫键的形成，主要原因是trxb（thioredoxinreductase）基因发生突变；另外一个是reca基因突变，改基因突变后外源质粒在宿主菌种中得以稳定存在。
4：大肠杆菌表达体系为什么会出现无或低蛋白表达的结果？
诱导前后蛋白存在毒性或者表达过程中密码子有偏向性，都可能造成蛋白不表达或低表达的结果。建议从以下几个方面来解决问题：
1）控制本底表达水平：基于lac-based启动子表达，加入葡萄糖；选择以葡萄糖为碳源培养基；基于t7-based启动子表达，使用含有t7溶酶体质粒；使用严谨控制型质粒，降低拷贝数。
2）控制诱导表达水平：采用可调节启动子；采用可控制诱导菌株；降低拷贝数；采用适用毒性蛋白表达菌株；采取分泌性表达策略。
3）优化质粒dna密码子，以适应宿主密码子体系使用密码子调整菌株。
4）增加生物质：尝试新培养基；改善通气条件，避免泡沐。
5：为什么会形成包涵体？
重组蛋白体系表达过程中，形成不正确的二硫键、进行错误的折叠、产生低可溶性蛋白，以及缺少翻译后修饰这一重要环节，都可能形成包涵体。可以采取以下策略来解决这些问题。
1）使用胞质具有氧化功能的e.coli进行分泌性表达。
2）共表达分子伴侣。
3）补充含有化合物伴侣和共因子的培养基。
4）移除诱导剂，增加新鲜培养基。
5）通过低温诱导表达或调整诱导剂浓度来降低表达速率。
6）改变融合伴侣蛋白，促进可溶蛋白表达。
7）改变表达宿主，如原核改变成真核表达系统。
义翘神州可提供从密码子优化到重组蛋白表达/纯化的一站式服务，并且可提供内毒素去除等附加服务以满足客户的定制需求。实验人员在可溶蛋白的表达纯化及包涵体变复性方面具有丰富经验，实验室保存有多种常用载体和宿主菌，可满足不同类型蛋白的重组表达，为客户提供优质的重组蛋白。大肠杆菌蛋白表达平台详情：cn.sinobiological com/services/platform/e-coli-protein-expression
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（1）菌体繁殖速度快：20分钟倍增一次，这意味着按照1/100的比例接种（moi），只需要几个小时培养基细菌即可到达稳定期；
（2）容易实现高密度培养：理论培养密度是1×1013cells/ml，实际培养过程中使用lb培养基在37℃培养大肠杆菌，<1×1010cells/ml。在低温（11℃）诱导蛋白表达时，细菌个数几乎不增长。
（3）转染外源dna容易，质粒转染效率高。
2：去除蛋白标签的方法有哪些？
去除蛋白标签的方法分为两类，一类是酶消化法；一类是化学裂解法。化学裂解法通常被用于融合伴侣蛋白的移除，如cnbr用于裂解与met氨基酸c-端连接的多肽，该方法优点是价格便宜，缺点是蛋白序列中不能存在met氨基酸残基。酶消化法是目前常用的蛋白标签去除方法，如腸激脢（enterokinase），凝血酶（thrombin），factorxa和烟草蚀刻病毒蛋白酶(tevprotease)等移除蛋白标签，只残留少数几个氨基酸残基。带有his标签的tev蛋白酶逐渐被广泛接受用于蛋白标签移除实验，该蛋白酶具有一个非常优秀的特点:切除标签后，只残留一个ser或gly残基或不残留氨基酸残基。
3：什么是合适的蛋白表达宿主？
重组蛋白原核表达常采用bl21（de3）和k-12衍生菌株作为表达宿主。bl21菌株缺乏lon蛋白酶和外膜蛋白酶ompt，lon蛋白酶主要功能是降解外源蛋白，外膜蛋白酶ompt主要功能是降解胞外基质蛋白。同时bl21菌株具有先天性的hsdsb基因突变，菌株失去甲基化和降解外源转染质粒的能力，使得质粒能够传代保留至子代细菌中（hsdsb突变基因来源于父辈b834菌株）。k-12系列菌株具有两大优点：一个是能够促进胞质中蛋白二硫键的形成，主要原因是trxb（thioredoxinreductase）基因发生突变；另外一个是reca基因突变，改基因突变后外源质粒在宿主菌种中得以稳定存在。
4：大肠杆菌表达体系为什么会出现无或低蛋白表达的结果？
诱导前后蛋白存在毒性或者表达过程中密码子有偏向性，都可能造成蛋白不表达或低表达的结果。建议从以下几个方面来解决问题：
1）控制本底表达水平：基于lac-based启动子表达，加入葡萄糖；选择以葡萄糖为碳源培养基；基于t7-based启动子表达，使用含有t7溶酶体质粒；使用严谨控制型质粒，降低拷贝数。
2）控制诱导表达水平：采用可调节启动子；采用可控制诱导菌株；降低拷贝数；采用适用毒性蛋白表达菌株；采取分泌性表达策略。
3）优化质粒dna密码子，以适应宿主密码子体系使用密码子调整菌株。
4）增加生物质：尝试新培养基；改善通气条件，避免泡沐。
5：为什么会形成包涵体？
重组蛋白体系表达过程中，形成不正确的二硫键、进行错误的折叠、产生低可溶性蛋白，以及缺少翻译后修饰这一重要环节，都可能形成包涵体。可以采取以下策略来解决这些问题。
1）使用胞质具有氧化功能的e.coli进行分泌性表达。
2）共表达分子伴侣。
3）补充含有化合物伴侣和共因子的培养基。
4）移除诱导剂，增加新鲜培养基。
5）通过低温诱导表达或调整诱导剂浓度来降低表达速率。
6）改变融合伴侣蛋白，促进可溶蛋白表达。
7）改变表达宿主，如原核改变成真核表达系统。
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