使用SpectraMax MiniMax细胞成像系统评估细胞迁移
简介
细胞迁移，广义上被定义为细胞从一个位置移动到另一个位置，在胚胎发育、创伤愈合等各种过程中发挥重要作用。它也是，癌细胞从原始位置扩散到身体不同部位转移的一个关键参数，参与包括肿瘤细胞侵袭、进入血管系统和远端定植等过程1。在体外，细胞会根据营养物质等化学信号发生迁移，这种化学吸引力可以用于研究细胞迁移机制。通过了解癌细胞迁移的机制，可以开发新的治疗方法来阻止癌症患者的癌细胞转移。
corningfluorobloktm嵌套可以将细胞悬浮液与含化学引诱剂的底层溶液分离，使研究人员能够测定细胞迁移或侵染。利用黑色染料处理的荧光屏蔽聚对苯二甲酸乙二醇酯（pet）膜可以有效地阻止的400-700nm光透射。荧光标记的细胞迁移通过膜中的8.0um孔径达到化学引诱剂，利用酶标仪或成像系统通过底部读取可以很容易检测到细胞（图1）。在检测过程中迁移细胞仍能存活，可实现终点和时间过程的测定。
使用fluoroblok嵌套，从微孔板底部读取原始荧光可用于测定细胞迁移，但这种方法存在局限性。标准化rfu（相对荧光）测量需要细胞的标准曲线，荧光细胞标记、背景荧光和其他条件的变化可能会影响数据准确性。通过直接计数细胞，研究人员可以获得准确的细胞迁移数据。
在这篇应用文章中，我们展示了如何使用spectramaxi3x多功能微孔板读板机和spectramax® minimax300细胞成像系统结合fluoroblok嵌套测量细胞迁移以及对细胞进行成像和计数。
优势
采集无损的高质量细胞图像
通过直接计数细胞获得准确的数据
使用softmax pro软件快速识别细胞
图1：fluoroblok技术。荧光标记的细胞被接种在fluoroblok嵌套中，通过8 um孔径迁移，从底部进行检测。
materials
•fluoroblokhts96孔多孔渗透支持系统，采用8.0 um高密度pet膜（corning cat. #351163）
•spectramaxi3x多功能微孔板读板机（molecular devices cat. #i3x）
•spectramaxminimax300细胞成像系统（molecular devices,cat. #5024062）
•nih3t3细胞（atcc cat. #crl-1658）
•最小必需培养基（mem,corningcat. #10-010）
•胎牛血清（fbs,geminibio-productscat. #100-106）
•0.05%胰蛋白酶edta（corning cat. #25-051-ci）
•earlytox活细胞检测试剂盒（molecular devices cat. #r8342）
方法
使用10%fbs在mem中培养nih3t3细胞。将细胞进行胰蛋白酶处理并重悬于无血清培养基中，然后用earlytox活细胞检测
试剂盒中的4 µm钙黄绿素am染色。染色后，在fluorobloktm嵌套中每孔加入20k 个细胞。将含有fbs的培养基作为细胞迁移的化学引诱剂，无血清培养基作为阴性对照。血清培养基被用作
阴性对照。
参数
细胞计数设置
光学配置
minimax
读板模式
成像
读板类型
终点法
波长设置
541 nm（绿色荧光）
成像的研究数量
９
图像采集设置
541 曝光：10 ms
541 调焦：240 µm
图像分析设置
分析类型：离散目标物
识别目标物所需波长：541 nm
表1 采集和分析设置
在softmax pro软件中创建自定义板设置，以适应fluoroblok的尺寸。在设置中的板类型窗口中选择编辑孔板，并根据corning提供的孔板信息修改尺寸。修改后的孔板设置被保存在新名称下。此自定义板设置参数可用于之后的fluoroblok实验。minimax细胞成像系统可用于采集通过pet膜迁移的nih3t3细胞的图像。使用表1中列出的采集设置，在20小时内的多个时间点采集图像。读板机的内部温度被设置为37°c，以在读板过程中最大限度地保证细胞健康。
图2. 目标物识别。使用softmax pro软件采集编辑器中的点单击（point and click）功能识别nih3t3细胞。在图a中，用户可以通过点击已知细胞（黄色标记）来设置荧光大小和强度。软件识别的对象标记为紫色（b）。使用分类工具，用户可以区分细胞（红色掩膜）和较小的孔（蓝色掩膜）（c）。
图3. 使用minimax细胞成像系统追踪细胞迁移。接种细胞后0小时（a和d）、接种后20小时（b和e）以及软件识别的对象（c和f）采集的图像。c和f中的红色掩膜表示分类为细胞的物体，蓝色掩膜表示分类为fluoroblok膜孔的小物体。顶行显示含有化学引诱剂的孔，底行显示不含化学引诱剂的孔（阴性对照）
使用softmax pro软件识别和定量迁移的nih3t3细胞。在图像分析设置中选择离散目标物分析作为分析类型。根据细胞荧光强度和大小识别细胞，在软件中创建自定义设置（图2）。通过点击4至6个代表性
细胞，可自动设置阈值，并由软件识别细胞。使用软件对迁移的细胞数量进行绘制。
结果
使用minimax细胞成像系统和softmax pro软件，在荧光染色细胞通过fluoroblok孔板迁移时对其进行检测（图3）。虽然在不含化学引诱剂的孔中也有一些迁移，但在化学引诱剂存在的情况下，20小时后细胞迁移增加近3倍（图4）。
图4. 细胞迁移计数。使用softmax pro软件对nih3t3细胞计数进行绘图。含有趋化剂的孔以红色显示，阴性对照孔以绿色显示。前两小时内两种条件处理的细胞均显示发生了迁移，但含有趋化剂的孔板中的细胞计数随着时间的推移持续增加。
结论
spectramaxi3x多功能微孔板读板机和minimax细胞成像系统可与fluoroblok细胞培养嵌套搭配使用，直接对高质量图像中的细胞进行计数，以测定细胞随时间的迁移情况。用户能够通过点击softmax pro软件的用户界面快速设置细胞计数分析。与容易受细胞染色水平和背景荧光影响的原始荧光相比，图像分析可提供准确的数据。通过将softmax pro软件的图像采集和分析功能与96孔fluoroblok嵌套相结合，研究人员可以快速评估大量细胞迁移数据，以推进其在癌症和许多其他生物学领域的研究。
参考文献
1. chambers, ann f., alan c. groom, and ian c. macdonald. metastasis: dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. nature reviews cancer nature reviews cancer 2.8（2002 年）：563.
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corningfluorobloktm嵌套可以将细胞悬浮液与含化学引诱剂的底层溶液分离，使研究人员能够测定细胞迁移或侵染。利用黑色染料处理的荧光屏蔽聚对苯二甲酸乙二醇酯（pet）膜可以有效地阻止的400-700nm光透射。荧光标记的细胞迁移通过膜中的8.0um孔径达到化学引诱剂，利用酶标仪或成像系统通过底部读取可以很容易检测到细胞（图1）。在检测过程中迁移细胞仍能存活，可实现终点和时间过程的测定。
使用fluoroblok嵌套，从微孔板底部读取原始荧光可用于测定细胞迁移，但这种方法存在局限性。标准化rfu（相对荧光）测量需要细胞的标准曲线，荧光细胞标记、背景荧光和其他条件的变化可能会影响数据准确性。通过直接计数细胞，研究人员可以获得准确的细胞迁移数据。
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优势
采集无损的高质量细胞图像
通过直接计数细胞获得准确的数据
使用softmax pro软件快速识别细胞
图1：fluoroblok技术。荧光标记的细胞被接种在fluoroblok嵌套中，通过8 um孔径迁移，从底部进行检测。
materials
•fluoroblokhts96孔多孔渗透支持系统，采用8.0 um高密度pet膜（corning cat. #351163）
•spectramaxi3x多功能微孔板读板机（molecular devices cat. #i3x）
•spectramaxminimax300细胞成像系统（molecular devices,cat. #5024062）
•nih3t3细胞（atcc cat. #crl-1658）
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方法
使用10%fbs在mem中培养nih3t3细胞。将细胞进行胰蛋白酶处理并重悬于无血清培养基中，然后用earlytox活细胞检测
试剂盒中的4 µm钙黄绿素am染色。染色后，在fluorobloktm嵌套中每孔加入20k 个细胞。将含有fbs的培养基作为细胞迁移的化学引诱剂，无血清培养基作为阴性对照。血清培养基被用作
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光学配置
minimax
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在softmax pro软件中创建自定义板设置，以适应fluoroblok的尺寸。在设置中的板类型窗口中选择编辑孔板，并根据corning提供的孔板信息修改尺寸。修改后的孔板设置被保存在新名称下。此自定义板设置参数可用于之后的fluoroblok实验。minimax细胞成像系统可用于采集通过pet膜迁移的nih3t3细胞的图像。使用表1中列出的采集设置，在20小时内的多个时间点采集图像。读板机的内部温度被设置为37°c，以在读板过程中最大限度地保证细胞健康。
图2. 目标物识别。使用softmax pro软件采集编辑器中的点单击（point and click）功能识别nih3t3细胞。在图a中，用户可以通过点击已知细胞（黄色标记）来设置荧光大小和强度。软件识别的对象标记为紫色（b）。使用分类工具，用户可以区分细胞（红色掩膜）和较小的孔（蓝色掩膜）（c）。
图3. 使用minimax细胞成像系统追踪细胞迁移。接种细胞后0小时（a和d）、接种后20小时（b和e）以及软件识别的对象（c和f）采集的图像。c和f中的红色掩膜表示分类为细胞的物体，蓝色掩膜表示分类为fluoroblok膜孔的小物体。顶行显示含有化学引诱剂的孔，底行显示不含化学引诱剂的孔（阴性对照）
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细胞，可自动设置阈值，并由软件识别细胞。使用软件对迁移的细胞数量进行绘制。
结果
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结论
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参考文献
1. chambers, ann f., alan c. groom, and ian c. macdonald. metastasis: dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. nature reviews cancer nature reviews cancer 2.8（2002 年）：563.
怎样使用恒温恒湿试验箱会更省电、更环保
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