【每周质检】小鼠胆管类器官培养效果测评
胆管作为肝脏的废物处理系统，有着至关重要的作用。胆管功能失常导致约30%的成人和70%的儿童需要接受肝移植，且现阶段还没有其他行之有效的治疗手段，但目前，随着肝病发病率的上升，可供移植的肝脏供不应求，因此迫切需要替代方案的出现。
2021年2月19日，剑桥大学mrc干细胞研究所的fotios sampaziotis等人在science上，发表了关于他们利用胆管细胞类器官成功对人体肝移植后的胆管修复成功的文章，这项研究为肝脏疾病的治疗开辟了新道路——胆管类器官。
本周质检做的正是小鼠胆管类器官，让我们看看怎么培养，培养效果如何。
一.
样本信息
模基基质胶
对照组
二.
实验流程
1.培养材料
（1）试剂：matrigengel matrix、小鼠胆管类器官培养试剂盒、类器官消化液、润洗液、基础培养基。
（2）耗材：48孔细胞培养板、离心管（规格为1.5ml）、移液器（规格为10μl、200μl、1000μl和5000μl）、无菌吸头（规格为10μl、200μl和1000μl）、40μm细胞过滤器。
2.实验前准备
（1）matrigengel matrix 4℃化冻
（2）小鼠胆管类器官培养基的制备：将200μl mouse liver ductal organoid supplement b (50x)，40μl mouse liver ductal organoid supplement c(250x)加至9.76ml mouse liver ductal organoid basal medium中，充分混合，配制成10ml小鼠胆管类器官培养基，室温平衡，可在2-8°c储存，建议在两周内使用。
3.类器官培养
以下操作吹打细胞的吸头均需用润洗液润洗后使用：
（1）小鼠胆管类器官收集：保留原有培养液，用移液管吸头轻轻刮下吹打细胞外基质和小鼠胆管类器官混合物，转移至1.5ml离心管中，吹打5~10次，使小鼠胆管类器官和细胞外基质分离，300g离心3分钟。
（2）小鼠胆管类器官消化：离心后，去除上清液，分别加入200μl类器官消化液，吹打混匀后置于37℃培养箱中消化。
（3）小鼠胆管类器官终止消化：类器官消化时间5分钟，吹打混匀，加入1ml基础培养基吹打混匀以终止消化反应，300g离心3分钟。
（4）细胞过滤：加入1ml基础培养基重悬细胞沉淀，用40μm细胞筛网过滤细胞悬液，收集滤液至新的离心管中，300g离心3分钟。
（5）小鼠胆管类器官清洗：离心后用基础培养基清洗1次收集至同一个离心管中，离心以去除残留的消化液。
（6）细胞计数：用1ml基础培养基重悬细胞，取18μl细胞悬液与2μl台盼蓝混匀，取10μl混合液加至血球计数板中，显微镜下观察计数,300g离心3分钟，弃上清。
（7）基质胶3d包裹：根据密度加入适量基础培养基重悬细胞，取5 μl细胞悬液至新的离心管中，每组分别与18μl不同的细胞外基质冰上混匀（注意，混匀吹打的动作要轻柔，切忌产生大量气泡，常温混匀则需要控制在15秒内），混匀后置于冰上。
（8）种板培养：用移液器吸取10μl细胞外基质和细胞的混合液移至培养板孔中，混合悬液须点在培养孔底部中央位置，其铺开后不可接触培养孔侧壁，平行2孔。将培养板放入37℃，在5%二氧化碳细胞培养箱中孵育20分钟，待细胞外基质凝固至不再流动后，沿孔壁缓缓加入250μl培养基。
（9）持续培养：将细胞培养板放入培养箱中进行培养，每1天于倒置显微镜下观察小鼠胆管类器官的生长状态，于倒置显微镜下拍照，记录多个视野中类器官的形态和分布。
三.
实验结果
四.
实验分析
模基基质胶与brand c基质胶均有良好的培养效果，两组实验胆管类器官均无明显贴壁现象，其中20224105cwd的培养效果会好一些。
模基生物基质胶经过严格的质检验证，具备安全性高、浓度多样性、批次稳定性好、低内毒素、无污染。在购买模基产品时，根据用户个性化的需求对用户进行最佳产品、货号的推荐。
进行类器官培养时，推荐使用低生长因子基质胶与类器官专用基质胶。低生长因子基质胶是进行了低因子处理的。在天然基底膜基质中含有微量生长因子，其中有egf、igf、vegf这类促进细胞生长分化的因子，也有tgf-β这类可能促进细胞凋亡的因子。低生长因子型基质胶减少干扰因子，能更好的进行人工诱导分化。而类器官专用基质胶则是经过多项附加测试验证，确定效果脱颖而出的低生长因子基质胶，培养效果稳定而又出众。
五.
参考资料
1.cholangiocyte organoids can repair bile ducts after transplantation in the human liver（science）
六.
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一.
样本信息
模基基质胶
对照组
二.
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1.培养材料
（1）试剂：matrigengel matrix、小鼠胆管类器官培养试剂盒、类器官消化液、润洗液、基础培养基。
（2）耗材：48孔细胞培养板、离心管（规格为1.5ml）、移液器（规格为10μl、200μl、1000μl和5000μl）、无菌吸头（规格为10μl、200μl和1000μl）、40μm细胞过滤器。
2.实验前准备
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（2）小鼠胆管类器官培养基的制备：将200μl mouse liver ductal organoid supplement b (50x)，40μl mouse liver ductal organoid supplement c(250x)加至9.76ml mouse liver ductal organoid basal medium中，充分混合，配制成10ml小鼠胆管类器官培养基，室温平衡，可在2-8°c储存，建议在两周内使用。
3.类器官培养
以下操作吹打细胞的吸头均需用润洗液润洗后使用：
（1）小鼠胆管类器官收集：保留原有培养液，用移液管吸头轻轻刮下吹打细胞外基质和小鼠胆管类器官混合物，转移至1.5ml离心管中，吹打5~10次，使小鼠胆管类器官和细胞外基质分离，300g离心3分钟。
（2）小鼠胆管类器官消化：离心后，去除上清液，分别加入200μl类器官消化液，吹打混匀后置于37℃培养箱中消化。
（3）小鼠胆管类器官终止消化：类器官消化时间5分钟，吹打混匀，加入1ml基础培养基吹打混匀以终止消化反应，300g离心3分钟。
（4）细胞过滤：加入1ml基础培养基重悬细胞沉淀，用40μm细胞筛网过滤细胞悬液，收集滤液至新的离心管中，300g离心3分钟。
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（6）细胞计数：用1ml基础培养基重悬细胞，取18μl细胞悬液与2μl台盼蓝混匀，取10μl混合液加至血球计数板中，显微镜下观察计数,300g离心3分钟，弃上清。
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（9）持续培养：将细胞培养板放入培养箱中进行培养，每1天于倒置显微镜下观察小鼠胆管类器官的生长状态，于倒置显微镜下拍照，记录多个视野中类器官的形态和分布。
三.
实验结果
四.
实验分析
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五.
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