从冻存的细胞提取RNA操作步骤
从冻存的细胞提取rna
1). 将冻存管从液氮或冰箱中取出；
2). 不待细胞溶解，将trizol500ul-1ml直接放入冻存管中，此时trizol会冻成冰状；
3). 将冻存管缓慢融化，并用加样器吹打混匀；
4). 将细胞裂解液移至eppendorf管中，16000′g离心1min，吸出管底絮状沉淀;
注释：该步骤并非必要，多数protocol省略该步骤，但加入该步中能明显提高rna的质量；注意不能离心时间过长，否则沉淀难以吸出，将200ul黄枪头尖部切去0.5cm操作；
5). 加入1/5体积的氯仿（约200ul）,上下颠倒2~3min；
6). 4℃ 16000′g离心15min，轻轻吸出上清至新的eppendorf管（约700ul ），不要扰动中间层或用手指使eppendorf管变温；
注释：一般情况下提取的rna已经足够，而且在逆转录过程中rna的质量要远较rna的数量更重要，一般仅取上清的上1/2左右足矣，这样可最大限度避免对于中间蛋白相的扰动；
7). 加入等体积异丙醇（约800ul）,充分混匀，冰上静置15min；
8). 4℃ 16000′g离心15min，轻轻倒掉上清，仅留管底沉淀；
9). 加入1ml预冷的无水乙醇，4℃ 16000′g离心2min，轻轻倒掉上清，仅留管底沉淀；
10). 倒置eppendorf管于干净滤纸上，至可见乙醇wan全挥发；
11). 用100ul 新鲜制备的depc处理过的milliq 水溶解rna，如果溶解不好，-20℃反复冻融1~2次，4℃ 16000′g离心3min，将上清吸至新的eppendorf管中；
12). 加入等体积12 m licl，-20℃静置15min；
13). 4℃ 16000′g离心15min，轻轻倒掉上清，仅留管底沉淀；
注释：该步骤的目的在于去除小分子降解rna和盐分；但可以省略；只有大分子rna在高浓度licl中沉淀，dna不会沉淀；
14). 加入1ml预冷的无水乙醇，4℃ 16000′g离心2min，轻轻倒掉上清，仅留管底沉淀；
注释：该步的目的在于去除licl，licl溶于乙醇，而rna不溶于乙醇，利用溶解度分离；
15). 倒置eppendorf管于干净滤纸上，至可见乙醇wan全挥发rna边缘呈半透明；
16). 用40ul新鲜制备的depc处理过的milliq 水溶解rna；
17). 取出5ul 用于紫外分光光度计测定和琼脂糖凝胶电泳，其余冻存-70℃。
注释：如果od260/od280＜1.8，则加入等体积trizol，按上述步骤重新提纯。
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3). 将冻存管缓慢融化，并用加样器吹打混匀；
4). 将细胞裂解液移至eppendorf管中，16000′g离心1min，吸出管底絮状沉淀;
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5). 加入1/5体积的氯仿（约200ul）,上下颠倒2~3min；
6). 4℃ 16000′g离心15min，轻轻吸出上清至新的eppendorf管（约700ul ），不要扰动中间层或用手指使eppendorf管变温；
注释：一般情况下提取的rna已经足够，而且在逆转录过程中rna的质量要远较rna的数量更重要，一般仅取上清的上1/2左右足矣，这样可最大限度避免对于中间蛋白相的扰动；
7). 加入等体积异丙醇（约800ul）,充分混匀，冰上静置15min；
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9). 加入1ml预冷的无水乙醇，4℃ 16000′g离心2min，轻轻倒掉上清，仅留管底沉淀；
10). 倒置eppendorf管于干净滤纸上，至可见乙醇wan全挥发；
11). 用100ul 新鲜制备的depc处理过的milliq 水溶解rna，如果溶解不好，-20℃反复冻融1~2次，4℃ 16000′g离心3min，将上清吸至新的eppendorf管中；
12). 加入等体积12 m licl，-20℃静置15min；
13). 4℃ 16000′g离心15min，轻轻倒掉上清，仅留管底沉淀；
注释：该步骤的目的在于去除小分子降解rna和盐分；但可以省略；只有大分子rna在高浓度licl中沉淀，dna不会沉淀；
14). 加入1ml预冷的无水乙醇，4℃ 16000′g离心2min，轻轻倒掉上清，仅留管底沉淀；
注释：该步的目的在于去除licl，licl溶于乙醇，而rna不溶于乙醇，利用溶解度分离；
15). 倒置eppendorf管于干净滤纸上，至可见乙醇wan全挥发rna边缘呈半透明；
16). 用40ul新鲜制备的depc处理过的milliq 水溶解rna；
17). 取出5ul 用于紫外分光光度计测定和琼脂糖凝胶电泳，其余冻存-70℃。
注释：如果od260/od280＜1.8，则加入等体积trizol，按上述步骤重新提纯。
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