细胞学堂 | 如何解决bEnd.3细胞形态变化、难消化
bend.3 [bend3] (小鼠脑微血管内皮细胞)是从来自患有内皮瘤的小鼠脑组织中分离的内皮细胞，该细胞通过表达多瘤病毒中间t抗原的ntkmt逆转录病毒载体感染而转化。在培养时，bend.3细胞最常遇到的问题就是细胞形态变化和难消化，本期细胞学堂将帮您逐一解决。
细胞形态问题
bend.3细胞本身生长较慢，在低密度时会呈现不规则细胞形态，高密度时则呈规则纤维状，所以若在培养过程中发现细胞形态异常，则有可能是细胞密度低，建议细胞铺满密度较高时传代。以下为bend.3细胞不同密度培养图片：
低密度（100倍镜）
中密度（100倍镜）
高密度（100倍镜）
消化问题
消化时间
bend.3细胞培养时间越长越难消化，培养4天传代，一般消化3-5分钟；培养7天传代，一般消化5-10分钟。具体消化时间以显微镜下观察细胞状态为准。
培养7天，消化5分钟显微图
培养7天，消化10分钟显微图
难消化问题
如遇到消化困难不必担心，可通过分次消化的方式解决，具体操作方法如下（以t25瓶细胞为例）：
01
吸出原培养液；
02
加入2ml左右pbs，轻轻晃动培养瓶润洗细胞，吸出pbs丢弃；
03
加入1ml左右胰酶，轻轻晃动培养瓶使之浸润所有细胞；
04
放入培养箱消化，消化3-5分钟（根据具体细胞稍作延长或缩短），显微镜下看到细胞开始漂浮，可以加入2mlpbs，晃动培养瓶使细胞悬浮，不要吹打剩下的贴壁细胞；
05
吸出培养瓶内的pbs和细胞悬液，转移到无菌离心管中，在离心管中加入3ml含血清的培养基终止消化并吹散细胞，使细胞尽量呈单颗细胞的悬浮液；
06
原培养瓶中加入0.5ml胰酶，晃动培养瓶浸润细胞，放入培养箱继续消化，直到细胞块中间全部收缩变圆，晃动培养瓶可脱落；
07
用3ml含血清的培养基终止消化，将瓶底的细胞全部吹下，并轻轻吹吸分散细胞呈单颗；
08
收集细胞悬液与第一次消化下来的细胞合并到一个离心管；
09
离心收集细胞沉淀，1200rpm/min 3分钟，离心完吸出上清丢弃；
10
加入新鲜培养基，吹打几下混匀细胞，按需接种到新培养瓶，补足培养基，拧松瓶盖或使用透气瓶盖进行培养；
11
检查培养箱二氧化碳，温度和水盘。
培养小贴士
01
细胞培养过程中形态多样，低密度时容易出现放射状细胞，看似已经铺满瓶底，其实细胞量较少，需要细胞胞体排列紧密的时候进行传代；
02
细胞培养过程中避免频繁换液，可以每隔2-3天换液或者半量换液一次；
03
培养过程中会产生10%左右活的单颗漂浮细胞，贴壁细胞密度偏低时，注意收集悬浮细胞，贴壁细胞密度偏高时，可以换液时丢弃；
04
接种量对细胞生长有影响，接种量过低细胞会有增殖缓慢，漂浮过多的现象，请注意控制传代比例；
05
细胞对温度和ph较敏感，传代或换液前培养基可以常温复温4小时以上；避免使用ph改变（偏酸：颜色偏黄；偏碱：颜色偏紫红）的培养基；
06
细胞传代过程中若出现单次消化时间过长，可进行分次消化，切不可将细胞强行吹下来，以避免吹打造成细胞机械损伤。
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bend.3细胞本身生长较慢，在低密度时会呈现不规则细胞形态，高密度时则呈规则纤维状，所以若在培养过程中发现细胞形态异常，则有可能是细胞密度低，建议细胞铺满密度较高时传代。以下为bend.3细胞不同密度培养图片：
低密度（100倍镜）
中密度（100倍镜）
高密度（100倍镜）
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难消化问题
如遇到消化困难不必担心，可通过分次消化的方式解决，具体操作方法如下（以t25瓶细胞为例）：
01
吸出原培养液；
02
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03
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04
放入培养箱消化，消化3-5分钟（根据具体细胞稍作延长或缩短），显微镜下看到细胞开始漂浮，可以加入2mlpbs，晃动培养瓶使细胞悬浮，不要吹打剩下的贴壁细胞；
05
吸出培养瓶内的pbs和细胞悬液，转移到无菌离心管中，在离心管中加入3ml含血清的培养基终止消化并吹散细胞，使细胞尽量呈单颗细胞的悬浮液；
06
原培养瓶中加入0.5ml胰酶，晃动培养瓶浸润细胞，放入培养箱继续消化，直到细胞块中间全部收缩变圆，晃动培养瓶可脱落；
07
用3ml含血清的培养基终止消化，将瓶底的细胞全部吹下，并轻轻吹吸分散细胞呈单颗；
08
收集细胞悬液与第一次消化下来的细胞合并到一个离心管；
09
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10
加入新鲜培养基，吹打几下混匀细胞，按需接种到新培养瓶，补足培养基，拧松瓶盖或使用透气瓶盖进行培养；
11
检查培养箱二氧化碳，温度和水盘。
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01
细胞培养过程中形态多样，低密度时容易出现放射状细胞，看似已经铺满瓶底，其实细胞量较少，需要细胞胞体排列紧密的时候进行传代；
02
细胞培养过程中避免频繁换液，可以每隔2-3天换液或者半量换液一次；
03
培养过程中会产生10%左右活的单颗漂浮细胞，贴壁细胞密度偏低时，注意收集悬浮细胞，贴壁细胞密度偏高时，可以换液时丢弃；
04
接种量对细胞生长有影响，接种量过低细胞会有增殖缓慢，漂浮过多的现象，请注意控制传代比例；
05
细胞对温度和ph较敏感，传代或换液前培养基可以常温复温4小时以上；避免使用ph改变（偏酸：颜色偏黄；偏碱：颜色偏紫红）的培养基；
06
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