使用氢化物发生法-ICP-MS高通量测定大米中的无机砷
摘要：本文开发出了一种利用氢化物发生 (hg) 技术与icp-ms分离并检测食品中无机 砷 (ias) 的快速而灵敏的方法。31 种市售大米中的无机砷含量测定值均低于现行 中国法规中规定的最大浓度 (ml) 150 µg/kg。对 hg-icp-ms 和 hplc-icp-ms 获得的数据进行比较后发现两种分析技术的检测限相当。 hg-icp-ms 是大规模筛选大米等食品样品的理想选择，因为这一技术仅需耗费 传统 hplc-icp-ms 方法通常所需时间的一小部分，且分析性能不受任何影响
前言：为确保食品安全，应对食品中的砷类化合物等潜在毒性化学 物质浓度进行密切监测。然而，砷类化合物的毒性取决于 所含该元素的化学形态或“种类”而非总浓度。亚砷suan盐 (as(iii)) 和砷suan盐 (as(v)) 等无机砷*具有高毒性和致癌 性，而单甲基胂酸 (mma) 和二甲基胂酸 (dma) 等有机砷 的毒性较低 [1]。由于这种毒性差异的存在，因此大量研究 致力于开发可靠而耐用的不同砷形态分离方法，以实现对毒 性形态的特异性定量分析。 虽然不同形态的色谱分离与随后的 icp-ms 形态特异性定 量分析已经成为了食品样品中痕量元素分离的*方法， 但还存在许多比高效液相色谱 (hplc) 更省时更经济的砷形 态分析非色谱策略 [2,3]。 本文重点介绍利用氢化物发生 (hg) 技术和 icp-ms 对大米 样品中的无机砷进行形态分析。大米是世界上大部分人口 的重要食物来源，但由于水稻吸收了土壤中的砷而使大米中 的无机砷浓度相对较高。土壤中的砷可能天然存在，也可 能来自人为来源，例如 20 世纪 70 年代前人们曾大量使用 含砷农药。显然目前迫切需要一种简单而快速的分析方法 来筛查大量样品中的无机砷以确保食品安全。
现行法规：中国已出台的法规中规定大米中无机砷的最大浓度 (ml) 为 0.15 mg/kg [4]，南美洲贸易集团则规定大米中总砷的最大 浓度为 0.3 mg/kg [5]。食品污染法典委员会举行第八次会 议后，世界卫生组织 (who) 建议精白米中的无机砷浓度不 得超过 0.2 mg/kg [6]。美国和欧盟尚未针对大米中的无机 砷浓度进行立法，但美国 fda 和欧洲标准化委员会 (cen) 已启动了致力于建立食品中无机砷测定标准方法的项目。
本研究评估了大米样品中无机砷测定的替代方法，证明无需 采用耗时的色谱方法也可进行无机砷形态分析。
样品与参比物质 样品中包括 31 种购自本地商店的不同大米以及 12 种在受 控砷暴露环境下生长的大米。使用咖啡研磨机将市售大米 样品的子样品 (30 g) 研磨成均匀的细粉。将 imep-107 大 米（比利时赫尔参比物质和测量研究所）和美国国家标准技 术研究院 (nist) 1568a 米粉 (gaithersburg, md, usa) 两 种大米参比物质用作无机砷浓度测定的质量控制。
样品前处理 在测定总砷含量时，每份样品取 0.15 g 置于敞口消解容器 中，加入 1 ml 浓 hno3 和 2 ml h2o2 (30% w/w)，并在 cem mars 微波系统中进行消解。使用去离子水将所有样 品稀释至最终体积为 30 ml。 利用 hplc-icp-ms 进行无机砷形态分析时，取大米样品 0.1 g 加入 10 ml 1% hno3 和 1% h2o2 中进行提取 (5 min 50 °c，5 min 75 °c，10 min 95 °c)。采用 hg-icp-ms 进 行分析时样品提取物制备与上述方法相同。此外采用 1% hno3 和 1% h2o2 以与样品相同的方式配制校准标样。分 析前将每份样品在 13000 rpm 下离心 10 min。
仪器 — 氢化物发生法 针对安捷伦icp-ms集成进样系统 (isis) 的氢化物发生附 件可用于砷等气态氢化物形成元素的高灵敏度分析。图 1 显示了本研究中所用的 hg-icp-ms 配置。通过 asx-500 自动进样器进样，并通过 isis 蠕动泵 (pp1) 将样品运输至 氢化物发生器。样品在混合线圈中与 hcl (5m)、nabh4 (2% (w/v)) 和消泡剂 b 乳浊液混合后进入气液分离器。随 后含有无机砷（以挥发性氢化物形式存在）的气态样品随 icp-ms 尾吹气路控制的氩气流被输送至 icp-ms 雾化室。 rh 内标 (is) 通过常规气动雾化器引入 icp-ms 雾化室，创 造出湿润的等离子体条件。方法开发的详细信息请参见之 前的文献 [7]。最佳运行条件如表 1 所示。
在酸性条件下利用 nabh4 进行处理后，无机砷可有效转为 成挥发性胂 (ash3)，而有机结合的砷化合物未被转化，或 仅形成了挥发性较弱的胂类化合物，如沸点为 35 °c 的二 甲胂 (ch3)2ash。加入高浓度盐酸可进一步减少挥发性较 弱的胂类化合物的产生，而无机砷几乎全部转化为胂，从而 无需使用色谱技术进行形态分离即可对无机砷进行单独测定。
仪器 — icp-ms 将 hg 与 agilent 8800 串联四极杆 icp-ms (icp-ms/ms) 串联以实现砷的检测。由于 icp-ms/ms 有助于对潜在干 扰物进行监测与控制，因此与传统四极杆 icp-qms 相比 更适用于初始方法开发。由于通过 hg 的胂选择性形成过 程中高浓度 hcl 增加了氯形成的 40ar35cl 对砷 (m/z 75) 造成干扰的机会，因此这一点非常重要。
使用 icp-ms/ms 测定砷的方法是利用质量转换方 法，在该方法中 as+ 与反应池气体氧气 (o2) 发生反应转 化成了 aso+ ，然后作为 m/z 91 的 as+ 子离子得到测定。 icp-ms/ms 能够在 ms/ms 模式下运行，在该模式中两 个四极杆均作为单位质量过滤器运行。如果将 q1 设置为 m/z 75，则仅有砷和原位质量干扰引入反应池，因此目标 子离子 75as16o+ m/z 91 的潜在干扰可被排除。而在初始研 究中 [7]，氧气反应模式（其中以 m/z 91 aso+ 的形式对 砷进行间接测定）和无气体模式（其中以 m/z 75 对砷进行 直接测定）下获得的 hg 结果之间并不存在差异，表明尽 管使用高浓度 hcl 也不存在显著的氯化物干扰。因此可在 agilent 7900 icp-ms 等四极杆 icp-ms 仪器中采用相同的 氢化物发生法对砷进行测定。
为将 hg-icp-ms/ms 结果与成熟 hplc-icp-ms 方法所 得的结果进行比较，我们将 agilent 1100 hplc 连接至 icp-ms/ms。实验中采用 hamilton prp x-100 阴离子 交换柱 (10 µm, 4.6 × 250 mm)，流动相为 20 mm 碳酸铵 (ph 8.5)，流速为 1 ml/min。
结果与讨论 质量控制 如表 3a 所示，icp-ms/ms 测定出的 nist 1568a 和 imep-107 中的总砷浓度与各自标准值和分析能力测试值 均呈现出良好的一致性。使用 hg-icp-ms/ms 测得的 nist 1568a 和 imep-107 中的无机砷形态分析结果与使 用 hplc-icp-ms/ms 测定的结果和报告值保持高度一致 （表 3b）。
两种 qc 物质均获得了良好的色谱柱回收率，其中 nist 1568a 为 101 ± 4% (n = 3)，imep-107 为 98 ± 9% (n = 12)。 对 imep-107 随每批样品共同进行了分析，通过这些多次测 量结果对“日内”rsd 和“日间”rsd 进行了计算。hg 和 hplc 的日内 rsd 平均值为 3%，所有测定日中的所有 重复测定均值 rsd 为 11%。结果显示两种方法的重现性和 重复性相似。分析每批样品时均对空白样品进行了分析。 hg-icp-ms/ms 和 hplc-icp-ms/ms 结果比较 多种大米中的总砷提取效率普遍较高，平均值为 91% ± 10%，范围为 73% - 111%。对于最大浓度而言，接受研究 的所有样品中无机砷含量均低于 150 µg/kg，因此均未超过 现行浓度和 fao/who 联合食品法典委员会的无 机砷建议最大浓度规定。所有样品的 hplc 色谱柱回收率 均可实现定量分析 (94% ± 10%)。
表 4a 和 4b 中汇总了无机砷、dma 和总砷的测定值。 hg-icp-ms 和 hplc-icp-ms 测得的无机砷结果显示出了 良好的一致性。大米中存在的主要砷形态为无机砷和 dma， mma 仅存在痕量水平。在使用 hcl (5 m) 和 nabh4 选 择性生成胂的方法中，ash3 几乎是所形成的产物，而 仅有少量 dma 产生约 2% - 4% 的二甲胂贡献。砷暴露环 境中生长大米的分析结果同样确定了这一点（表 4b）。尽 管样品含有高浓度 dma，但 hg-icp-ms 测得的无机砷与 hplc-icp-ms 测得的结果仍具有良好一致性。mma 可通 过该方法形成甲基胂，转化率约为 40%；但由于大米中通 常不含 mma 或仅含痕量 mma，因此应不会对无机砷的 定量分析造成影响。
表 4a 中的结果显示了所有市售大米产品中的无机砷浓度均 低于 fao/who 食品法典委员会的 200 µg/kg 建议最大浓 度和 150 µg/kg 的中国法规最大浓度，即使修正了无机砷 提取物的低回收率后也是如此。如果仅以总砷浓度评估砷含 量，则 32%（31 个样品中的 10 种）样品超过了食品法典 委员会的建议最大浓度，且 42%（31 个样品中的 13 种） 超过了现行中国法规最大浓度。研究得出市售大米样品中 以无机砷形态存在的砷占总砷浓度的 26% - 84%。 在检出 mma 的样品中，多数样品中的 mma 浓度低于 loq，且任何样品中的 mma 浓度均未超过 7 µg/kg。这 与美国 fda 开展的大规模调查（共检测约 1300 多个大米样 品）中获得的结果一致 [9]。在美国 fda 的调查中，97% 或 以上大米产品中的 mma 浓度低于 lod 或 loq（13 µg/kg 以下）。仅 1% 的样品含有 20 µg/kg 以上的 mma，最高 报告浓度为 25 µg/kg。由此可以假定 mma 在大米总砷 浓度中并非决定性因素，这一低浓度下的 mma 不会影响 hg-icp-ms/ms 对无机砷的测定结果。
结论 本研究使用安捷伦氢化物发生器/isis 联用 agilent 8800 icp-ms/ms 对 43 种大米样品提取物中低 ppb 水平的无 机砷 (ias) 进行了测定。hg-icp-ms/ms 获得的结果与 hplc-icp-ms/ms 结果在较宽的线性范围内均呈现良好的 一致性，且具有相似的检测限。 在通过微波提取进行简单的样品前处理后利用 hg-icpms/ms 对无机砷和 dma 进行了快速在线分离。之前的 研究结果显示 hg-icp-ms/ms 的总运行时间仅为 4 分钟/ 样品（5 次重复测定），而 hplc 进行一次测定通常需要 5 - 10 分钟/样品 [10]。由于无需进行色谱峰积分，因此 hg 方法的数据处理也非常简单。 全新 hg-icp-ms 方法实现了更快的分析时间、更高的通量 和简单可靠的操作。这使该方法极其适用于筛查大量食品 样品，以满足不断增加的食品（尤其是大米产品）中无机砷 常规测定要求。
关键词：蠕动泵 色谱柱
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现行法规：中国已出台的法规中规定大米中无机砷的最大浓度 (ml) 为 0.15 mg/kg [4]，南美洲贸易集团则规定大米中总砷的最大 浓度为 0.3 mg/kg [5]。食品污染法典委员会举行第八次会 议后，世界卫生组织 (who) 建议精白米中的无机砷浓度不 得超过 0.2 mg/kg [6]。美国和欧盟尚未针对大米中的无机 砷浓度进行立法，但美国 fda 和欧洲标准化委员会 (cen) 已启动了致力于建立食品中无机砷测定标准方法的项目。
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样品与参比物质 样品中包括 31 种购自本地商店的不同大米以及 12 种在受 控砷暴露环境下生长的大米。使用咖啡研磨机将市售大米 样品的子样品 (30 g) 研磨成均匀的细粉。将 imep-107 大 米（比利时赫尔参比物质和测量研究所）和美国国家标准技 术研究院 (nist) 1568a 米粉 (gaithersburg, md, usa) 两 种大米参比物质用作无机砷浓度测定的质量控制。
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仪器 — 氢化物发生法 针对安捷伦icp-ms集成进样系统 (isis) 的氢化物发生附 件可用于砷等气态氢化物形成元素的高灵敏度分析。图 1 显示了本研究中所用的 hg-icp-ms 配置。通过 asx-500 自动进样器进样，并通过 isis 蠕动泵 (pp1) 将样品运输至 氢化物发生器。样品在混合线圈中与 hcl (5m)、nabh4 (2% (w/v)) 和消泡剂 b 乳浊液混合后进入气液分离器。随 后含有无机砷（以挥发性氢化物形式存在）的气态样品随 icp-ms 尾吹气路控制的氩气流被输送至 icp-ms 雾化室。 rh 内标 (is) 通过常规气动雾化器引入 icp-ms 雾化室，创 造出湿润的等离子体条件。方法开发的详细信息请参见之 前的文献 [7]。最佳运行条件如表 1 所示。
在酸性条件下利用 nabh4 进行处理后，无机砷可有效转为 成挥发性胂 (ash3)，而有机结合的砷化合物未被转化，或 仅形成了挥发性较弱的胂类化合物，如沸点为 35 °c 的二 甲胂 (ch3)2ash。加入高浓度盐酸可进一步减少挥发性较 弱的胂类化合物的产生，而无机砷几乎全部转化为胂，从而 无需使用色谱技术进行形态分离即可对无机砷进行单独测定。
仪器 — icp-ms 将 hg 与 agilent 8800 串联四极杆 icp-ms (icp-ms/ms) 串联以实现砷的检测。由于 icp-ms/ms 有助于对潜在干 扰物进行监测与控制，因此与传统四极杆 icp-qms 相比 更适用于初始方法开发。由于通过 hg 的胂选择性形成过 程中高浓度 hcl 增加了氯形成的 40ar35cl 对砷 (m/z 75) 造成干扰的机会，因此这一点非常重要。
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为将 hg-icp-ms/ms 结果与成熟 hplc-icp-ms 方法所 得的结果进行比较，我们将 agilent 1100 hplc 连接至 icp-ms/ms。实验中采用 hamilton prp x-100 阴离子 交换柱 (10 µm, 4.6 × 250 mm)，流动相为 20 mm 碳酸铵 (ph 8.5)，流速为 1 ml/min。
结果与讨论 质量控制 如表 3a 所示，icp-ms/ms 测定出的 nist 1568a 和 imep-107 中的总砷浓度与各自标准值和分析能力测试值 均呈现出良好的一致性。使用 hg-icp-ms/ms 测得的 nist 1568a 和 imep-107 中的无机砷形态分析结果与使 用 hplc-icp-ms/ms 测定的结果和报告值保持高度一致 （表 3b）。
两种 qc 物质均获得了良好的色谱柱回收率，其中 nist 1568a 为 101 ± 4% (n = 3)，imep-107 为 98 ± 9% (n = 12)。 对 imep-107 随每批样品共同进行了分析，通过这些多次测 量结果对“日内”rsd 和“日间”rsd 进行了计算。hg 和 hplc 的日内 rsd 平均值为 3%，所有测定日中的所有 重复测定均值 rsd 为 11%。结果显示两种方法的重现性和 重复性相似。分析每批样品时均对空白样品进行了分析。 hg-icp-ms/ms 和 hplc-icp-ms/ms 结果比较 多种大米中的总砷提取效率普遍较高，平均值为 91% ± 10%，范围为 73% - 111%。对于最大浓度而言，接受研究 的所有样品中无机砷含量均低于 150 µg/kg，因此均未超过 现行浓度和 fao/who 联合食品法典委员会的无 机砷建议最大浓度规定。所有样品的 hplc 色谱柱回收率 均可实现定量分析 (94% ± 10%)。
表 4a 和 4b 中汇总了无机砷、dma 和总砷的测定值。 hg-icp-ms 和 hplc-icp-ms 测得的无机砷结果显示出了 良好的一致性。大米中存在的主要砷形态为无机砷和 dma， mma 仅存在痕量水平。在使用 hcl (5 m) 和 nabh4 选 择性生成胂的方法中，ash3 几乎是所形成的产物，而 仅有少量 dma 产生约 2% - 4% 的二甲胂贡献。砷暴露环 境中生长大米的分析结果同样确定了这一点（表 4b）。尽 管样品含有高浓度 dma，但 hg-icp-ms 测得的无机砷与 hplc-icp-ms 测得的结果仍具有良好一致性。mma 可通 过该方法形成甲基胂，转化率约为 40%；但由于大米中通 常不含 mma 或仅含痕量 mma，因此应不会对无机砷的 定量分析造成影响。
表 4a 中的结果显示了所有市售大米产品中的无机砷浓度均 低于 fao/who 食品法典委员会的 200 µg/kg 建议最大浓 度和 150 µg/kg 的中国法规最大浓度，即使修正了无机砷 提取物的低回收率后也是如此。如果仅以总砷浓度评估砷含 量，则 32%（31 个样品中的 10 种）样品超过了食品法典 委员会的建议最大浓度，且 42%（31 个样品中的 13 种） 超过了现行中国法规最大浓度。研究得出市售大米样品中 以无机砷形态存在的砷占总砷浓度的 26% - 84%。 在检出 mma 的样品中，多数样品中的 mma 浓度低于 loq，且任何样品中的 mma 浓度均未超过 7 µg/kg。这 与美国 fda 开展的大规模调查（共检测约 1300 多个大米样 品）中获得的结果一致 [9]。在美国 fda 的调查中，97% 或 以上大米产品中的 mma 浓度低于 lod 或 loq（13 µg/kg 以下）。仅 1% 的样品含有 20 µg/kg 以上的 mma，最高 报告浓度为 25 µg/kg。由此可以假定 mma 在大米总砷 浓度中并非决定性因素，这一低浓度下的 mma 不会影响 hg-icp-ms/ms 对无机砷的测定结果。
结论 本研究使用安捷伦氢化物发生器/isis 联用 agilent 8800 icp-ms/ms 对 43 种大米样品提取物中低 ppb 水平的无 机砷 (ias) 进行了测定。hg-icp-ms/ms 获得的结果与 hplc-icp-ms/ms 结果在较宽的线性范围内均呈现良好的 一致性，且具有相似的检测限。 在通过微波提取进行简单的样品前处理后利用 hg-icpms/ms 对无机砷和 dma 进行了快速在线分离。之前的 研究结果显示 hg-icp-ms/ms 的总运行时间仅为 4 分钟/ 样品（5 次重复测定），而 hplc 进行一次测定通常需要 5 - 10 分钟/样品 [10]。由于无需进行色谱峰积分，因此 hg 方法的数据处理也非常简单。 全新 hg-icp-ms 方法实现了更快的分析时间、更高的通量 和简单可靠的操作。这使该方法极其适用于筛查大量食品 样品，以满足不断增加的食品（尤其是大米产品）中无机砷 常规测定要求。
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