细胞染色专题——荧光染料选择指南
细胞培养后，需要对其生长情况、形态甚至生物学性状进行观察。由于细胞小而复杂，若不借助适当的手段，难以观察其形态、结构，更难发现细胞内各种组分的分子组成及功能。目前，已有多种研究细胞的技术，从光学显微镜到电子显微镜，从一般细胞化学法到免疫化学法。细胞染色是研究细胞生物学特征的一种常用手段，然而，对于细胞实验新手来说，想要获得一张漂亮的细胞染色图并不容易。染色试剂不会选、细胞染色不均匀、染色时切片脱落等都是很常见的问题。今天小爱就为大家整理了几种常用细胞染色方法及染色剂选择指南，快来学习！
表1 几种常用细胞染色方法及特点
染色方法 染色特点及应用范围
革兰氏染色法 一种重要的细菌鉴别染色法，经染色后，阳性菌呈紫色，阴性菌呈红色，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，从而用以分类鉴定。
瑞氏染色法 瑞氏试剂中酸性伊红和碱性美蓝混合经化学作用后，变成中性的伊红化美蓝，久置后，经氧化而含有天青。此三种染料分别和细胞中的nh3+和coo-等结合，使细胞核及胞浆着色。由于系中性染料，又有缓冲液调节酸碱度，所以细胞受染后，蓝红等颜色都较适中，核染质、胞浆以及其中颗粒显色较为清楚。
姬姆萨染色法 病理学以及疾病研究中常用的染色剂。染色原理和结果与瑞氏染色法基本相同。但该法对细胞核和寄生虫着色较好，结构显示更清晰，而细胞质和中性颗粒则着色较差。为兼顾二者之长，可用复合染色法。
免疫组化染色法 利用抗原抗体之间的特异性结合，用于研究细胞产物如分子、蛋白质或糖蛋白的表达、定位、分布和迁移等。
了解细胞染色方法后，下面小爱向大家介绍研究不同细胞结构用到的荧光染料。
一、细胞膜常用染料
did、dir、dio和dii染料是最常见的细胞膜染料（见表2），它们是一族亲脂性的荧光染料，用于细胞的形态学和结构研究。该系列染料进入细胞膜后，会在整个细胞膜上侧向扩散，在最佳浓度时可以使整个细胞膜染色。其中did染料的染色效率高，染色均一，荧光不易猝灭，无明显细胞毒性，且受自身荧光背景干扰小。目前did已成功应用于多种细胞的体内示踪研究，如treg细胞、间充质干细胞、肿瘤细胞、造血干祖细胞等。
表2 细胞膜常用染料及荧光颜色
货号 产品名称 荧光颜色 λex(nm)/ λem (nm)
abs47048165 did 对氯苯磺酸盐 红色 644/663
abs45153692 dir 碘化物 深红色 748/780
abs45153674 dio 高氯酸盐 绿色 484/501
abs42002237 dii 高氯酸盐 橙色 549/565
二、其他细胞结构常用染料
生物染料在细胞结构和组分鉴定中有着广泛的应用，除细胞膜研究外，我们经常也会对一些其它细胞结构及成分进行探索，例如线粒体、溶酶体、蛋白质、细胞核等，而对于不同的细胞结构有不同的染料进行染色，小爱总结如下：
表3常用细胞染料及用途
货号 产品名称 产品用途
abs47047616 dapi染色液 细胞和组织细胞核染色。
abs47048270 tritc- phalloidin 选择性结合丝状肌动蛋白f-actin，用于细胞骨架研究。
abs47047622 台盼蓝染色液(0.4%) 常用于检测细胞膜完整性和细胞存活率。
abs47047618 姬姆萨染液 用于染色体、血液、组织切片、原生动物寄生虫等。
abs47047620 hoechst 33342 标记dna，也用于细胞核和线粒体的显像观察。
abs47047744 jc-10 可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。
abs47014951 吖啶橙盐酸盐 细胞周期研究，细胞培养物和组织模型的凋亡研究。也能用作溶酶体染料，但缺乏特异性。
abs42023979 (+)生物素-n-琥珀酰亚胺基酯 在温和条件下标记蛋白质、肽、细胞器、抗体、寡核苷酸和微珠。
三、细胞染色神器dapi + phalloidin
dapi染色液(dapi staining solution)常用于细胞核染色，可将细胞核染成蓝色。鬼笔环肽（phalloidin）是细胞骨架的染色神器，罗丹明标记的phalloidin（tritc- phalloidin）可将细胞染成橙红色，dapi与phalloidin染色液是研究细胞形态变化时经常用到的两种共染的试剂，染色效果可见图1[1]：a1-e1用tritc-鬼笔环肽（橙红）染色的细胞骨架免疫荧光图；a2-e2用dapi（蓝色）染色的细胞核免疫荧光图；a3-e3合并的l929细胞免疫荧光染色图。图2[2]是s100a16过表达或下调前后pdac细胞形态的变化。
图1 p34hb纤维支架敷料培养的l929的细胞毒性评估[1]。
图2 试剂处理后pdac细胞形态变化[2]。
注意事项：
1.荧光染料都存在淬灭的问题，建议染色后尽快检测。2、避免反复冻融，否则容易失效。3、dapi对人体有刺激性，注意适当防护。4、鬼笔环肽具有毒性，需小心操作（对人的半数致死剂量 ld50 约 2mg/kg）。
细胞染色专题---荧光染料选择指南
参考文献：
[1] li j, chen jn, peng zx, et al. multifunctional electrospinning polyhydroxyalkanoate fibrous scaffolds with antibacterial and angiogenesis effects for accelerating wound healing[j]. applied materials & interfaces. 2022.
[2] li t, ren ty, huang cm, et al. ys100a16 induces epithelial-mesenchymal transition in human pdac cells and is a new therapeutic target for pancreatic cancer treatment that synergizes with gemcitabine[j]. biochemical pharmacology 189 (2021) 114396.
常见问题解答（faq）
question answer
q1：用dapi和鬼笔环肽染细胞的先后顺序是什么？ 一般情况下先用鬼笔环肽对细胞骨架进行染色20~40分钟，pbs清洗细胞2次，再用dapi复染10~20分钟。可根据实际染色情况缩短或延长时间。
q2：用dapi染细胞核时，整张图片显示蓝色是什么原因？ 染色时应注意滴加量不要太多，否则会造成整张图像呈现蓝色背景，只需覆盖上薄薄的一层即可。此外，荧光染料存在淬灭的问题，建议染色后尽快检测。
q3：dapi染色中避光的操作到底要多严格才不至于影响结果？ dapi相对很容易染上色，避光处理时加样等操作短时见光没有关系，但是不操作的时候需要暗盒或锡纸包裹，染色后应尽快检测。
q4：我的细胞样品转染了带有gfp的质粒，应该选择哪种鬼笔环肽？ 可以选择tritc（橙红）或是fluor 700（远红）标记的鬼笔环肽。
q5：鬼笔环肽有好多种，它们的区别是什么？我应该如何选择？ 主要是荧光基团的差异，激发不同的荧光颜色，用来区分共染时其他荧光染料的颜色，选择时应满足机器激发和发射波长。
q6：鬼笔环肽可以染活细胞吗？什么染色剂可以染活细胞？ 鬼笔环肽不能直接应用于活细胞的染色，因为它无法穿越细胞膜。dapi可以透过完整的细胞膜，它可以用于活细胞和固定细胞的染色。
温馨提示：absin所有产品仅作科研实验使用，不支持临床等研究，请勿药物、家用或其他用途。
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瑞氏染色法 瑞氏试剂中酸性伊红和碱性美蓝混合经化学作用后，变成中性的伊红化美蓝，久置后，经氧化而含有天青。此三种染料分别和细胞中的nh3+和coo-等结合，使细胞核及胞浆着色。由于系中性染料，又有缓冲液调节酸碱度，所以细胞受染后，蓝红等颜色都较适中，核染质、胞浆以及其中颗粒显色较为清楚。
姬姆萨染色法 病理学以及疾病研究中常用的染色剂。染色原理和结果与瑞氏染色法基本相同。但该法对细胞核和寄生虫着色较好，结构显示更清晰，而细胞质和中性颗粒则着色较差。为兼顾二者之长，可用复合染色法。
免疫组化染色法 利用抗原抗体之间的特异性结合，用于研究细胞产物如分子、蛋白质或糖蛋白的表达、定位、分布和迁移等。
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一、细胞膜常用染料
did、dir、dio和dii染料是最常见的细胞膜染料（见表2），它们是一族亲脂性的荧光染料，用于细胞的形态学和结构研究。该系列染料进入细胞膜后，会在整个细胞膜上侧向扩散，在最佳浓度时可以使整个细胞膜染色。其中did染料的染色效率高，染色均一，荧光不易猝灭，无明显细胞毒性，且受自身荧光背景干扰小。目前did已成功应用于多种细胞的体内示踪研究，如treg细胞、间充质干细胞、肿瘤细胞、造血干祖细胞等。
表2 细胞膜常用染料及荧光颜色
货号 产品名称 荧光颜色 λex(nm)/ λem (nm)
abs47048165 did 对氯苯磺酸盐 红色 644/663
abs45153692 dir 碘化物 深红色 748/780
abs45153674 dio 高氯酸盐 绿色 484/501
abs42002237 dii 高氯酸盐 橙色 549/565
二、其他细胞结构常用染料
生物染料在细胞结构和组分鉴定中有着广泛的应用，除细胞膜研究外，我们经常也会对一些其它细胞结构及成分进行探索，例如线粒体、溶酶体、蛋白质、细胞核等，而对于不同的细胞结构有不同的染料进行染色，小爱总结如下：
表3常用细胞染料及用途
货号 产品名称 产品用途
abs47047616 dapi染色液 细胞和组织细胞核染色。
abs47048270 tritc- phalloidin 选择性结合丝状肌动蛋白f-actin，用于细胞骨架研究。
abs47047622 台盼蓝染色液(0.4%) 常用于检测细胞膜完整性和细胞存活率。
abs47047618 姬姆萨染液 用于染色体、血液、组织切片、原生动物寄生虫等。
abs47047620 hoechst 33342 标记dna，也用于细胞核和线粒体的显像观察。
abs47047744 jc-10 可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。
abs47014951 吖啶橙盐酸盐 细胞周期研究，细胞培养物和组织模型的凋亡研究。也能用作溶酶体染料，但缺乏特异性。
abs42023979 (+)生物素-n-琥珀酰亚胺基酯 在温和条件下标记蛋白质、肽、细胞器、抗体、寡核苷酸和微珠。
三、细胞染色神器dapi + phalloidin
dapi染色液(dapi staining solution)常用于细胞核染色，可将细胞核染成蓝色。鬼笔环肽（phalloidin）是细胞骨架的染色神器，罗丹明标记的phalloidin（tritc- phalloidin）可将细胞染成橙红色，dapi与phalloidin染色液是研究细胞形态变化时经常用到的两种共染的试剂，染色效果可见图1[1]：a1-e1用tritc-鬼笔环肽（橙红）染色的细胞骨架免疫荧光图；a2-e2用dapi（蓝色）染色的细胞核免疫荧光图；a3-e3合并的l929细胞免疫荧光染色图。图2[2]是s100a16过表达或下调前后pdac细胞形态的变化。
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注意事项：
1.荧光染料都存在淬灭的问题，建议染色后尽快检测。2、避免反复冻融，否则容易失效。3、dapi对人体有刺激性，注意适当防护。4、鬼笔环肽具有毒性，需小心操作（对人的半数致死剂量 ld50 约 2mg/kg）。
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question answer
q1：用dapi和鬼笔环肽染细胞的先后顺序是什么？ 一般情况下先用鬼笔环肽对细胞骨架进行染色20~40分钟，pbs清洗细胞2次，再用dapi复染10~20分钟。可根据实际染色情况缩短或延长时间。
q2：用dapi染细胞核时，整张图片显示蓝色是什么原因？ 染色时应注意滴加量不要太多，否则会造成整张图像呈现蓝色背景，只需覆盖上薄薄的一层即可。此外，荧光染料存在淬灭的问题，建议染色后尽快检测。
q3：dapi染色中避光的操作到底要多严格才不至于影响结果？ dapi相对很容易染上色，避光处理时加样等操作短时见光没有关系，但是不操作的时候需要暗盒或锡纸包裹，染色后应尽快检测。
q4：我的细胞样品转染了带有gfp的质粒，应该选择哪种鬼笔环肽？ 可以选择tritc（橙红）或是fluor 700（远红）标记的鬼笔环肽。
q5：鬼笔环肽有好多种，它们的区别是什么？我应该如何选择？ 主要是荧光基团的差异，激发不同的荧光颜色，用来区分共染时其他荧光染料的颜色，选择时应满足机器激发和发射波长。
q6：鬼笔环肽可以染活细胞吗？什么染色剂可以染活细胞？ 鬼笔环肽不能直接应用于活细胞的染色，因为它无法穿越细胞膜。dapi可以透过完整的细胞膜，它可以用于活细胞和固定细胞的染色。
温馨提示：absin所有产品仅作科研实验使用，不支持临床等研究，请勿药物、家用或其他用途。
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