AIM自诱导培养基介绍
自诱导培养基(lac启动子)(auto-induction medium)产品及特点本产品是在pet专用生长培养基的基础上开发而成的,它利用e.coli自身对培养 基中碳源和能源的调控利用机制,实现外源蛋白在细菌达到饱和期后的自动诱发。具有下列特点:1. 不需添加任何iptg或相关诱导物,节约成本。2. 免去了密切监控菌液密度的过程,尤其适合大规模筛选 。3. 细菌生长密度远高于iptg诱导表达系统 。4. 外源蛋白表达量远远高于iptg诱导表达系统。5. 本产品即开即用,操作简单 。6. 与各种细胞培养容器兼容(如培养瓶、培养罐、深孔管、发酵罐等)。
自诱导培养基(lac启动子)(auto-induction medium)操作步骤
(一)获得目的基因
1、通过pcr方法:以含目的基因的克隆质粒为模板,按基因序列设计一对引物(在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点),pcr循环获得所需基因片段。
2、通过rt-pcr方法:用trizol法从细胞或组织中提取总rna,以mrna为模板,逆转录形成cdna第一链,以逆转录产物为模板进行pcr循环获得产物。
(二)构建重组表达载体
1、自诱导培养基(lac启动子)(auto-induction medium)载体酶切:将表达质粒用限制性内切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切,酶切产物行琼脂糖电泳后,用胶回收kit或冻融法回收载体大片段。
2、pcr产物双酶切后回收,在t4dna连接酶作用下连接入载体。
(三) 获得含重组表达质粒的表达菌种
1、 将连接产物转化大肠杆菌dh5α,根据重组载体的标志(抗amp或蓝白斑)作筛选,挑取单斑,碱裂解法小量抽提质粒,双酶切初步鉴定。
2、 测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆,重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。
3、 以此重组质粒dna转化表达宿主菌的感受态细胞。
(四)诱导表达
1、 自诱导培养基(lac启动子)(auto-induction medium)挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml lb(含amp50μg/ml)中37℃过夜培养。
2、按1∶50比例稀释过夜菌,一般将1ml菌加入到含50mllb培养基的300ml培养瓶中, 37℃震荡培养至od600≌0.4-1.0(*0.6,大约需3hr)。
3、取部分液体作为未诱导的对照组,余下的加入iptg诱导剂至终浓度0.4mm作为实验组,两组继续37℃震荡培养3hr。
4、分别取菌体1ml, 离心12000g×30s收获沉淀,用100μl 1%sds重悬,混匀, 70℃10min。
5、离心12000g×1min,取上清作为样品,可做sds-page等分析。
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2、通过rt-pcr方法:用trizol法从细胞或组织中提取总rna,以mrna为模板,逆转录形成cdna第一链,以逆转录产物为模板进行pcr循环获得产物。
(二)构建重组表达载体
1、自诱导培养基(lac启动子)(auto-induction medium)载体酶切:将表达质粒用限制性内切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切,酶切产物行琼脂糖电泳后,用胶回收kit或冻融法回收载体大片段。
2、pcr产物双酶切后回收,在t4dna连接酶作用下连接入载体。
(三) 获得含重组表达质粒的表达菌种
1、 将连接产物转化大肠杆菌dh5α,根据重组载体的标志(抗amp或蓝白斑)作筛选,挑取单斑,碱裂解法小量抽提质粒,双酶切初步鉴定。
2、 测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆,重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。
3、 以此重组质粒dna转化表达宿主菌的感受态细胞。
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1、 自诱导培养基(lac启动子)(auto-induction medium)挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml lb(含amp50μg/ml)中37℃过夜培养。
2、按1∶50比例稀释过夜菌,一般将1ml菌加入到含50mllb培养基的300ml培养瓶中, 37℃震荡培养至od600≌0.4-1.0(*0.6,大约需3hr)。
3、取部分液体作为未诱导的对照组,余下的加入iptg诱导剂至终浓度0.4mm作为实验组,两组继续37℃震荡培养3hr。
4、分别取菌体1ml, 离心12000g×30s收获沉淀,用100μl 1%sds重悬,混匀, 70℃10min。
5、离心12000g×1min,取上清作为样品,可做sds-page等分析。
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