各种细胞传代的方法＆操作(细胞传代,细胞系)
1.当细胞铺满整个平皿(100mm)后,吸弃旧培养液，10mlpbs洗一遍
2.0.25%胰mei（预热20分钟左右）2ml消化，轻轻摇晃，直至肉眼见单层细胞呈块状脱落（或在显微镜下观察细胞之间分离），立刻加5ml(dmem+10%fbs)终止消化，轻柔吹打8-10次成单细胞。
3.离心1000rpm*5min,弃上清，加dmem+10%fbs轻柔吹打。
4.将细胞悬液1:4传到100mm细胞培养皿中，每个皿加10ml(dmem+10%fbs)培养液，正常情况下2-3天就可以长满，期间不用换液。
小鼠es-r1细胞系传代。
因为我们用饲养层细胞铺皿而不是明胶包被，所以传代之前必须处理饲养层细胞。
1.饲养层细胞sto处理：当sto铺满平皿后，向培养液中加入100ul 1mg/mlmitomycinc(toxic,操作时不要接触，作用是抑制sto增殖)，轻轻摇晃平皿，保证分布均匀，放置于培养箱中处理2h后，吸弃培养液，10mlpbs洗两遍（目的是把mitomycinc洗净），0.25%胰mei消化，5ml(dmem+10%fbs)终止，离心1000rpm*5min弃上清，加dmem+10%fbs后吹打均匀，种到新的100mm细胞培养皿，补齐培养液至10ml。置于培养箱中过夜。
2.第二天早上传干细胞：
（1）吸弃旧培养液，10mlpbs洗一遍，2ml 0.25%胰mei消化，边消化边轻轻晃动培养皿，4-5min后镜下观察发现发部分细胞脱落，成小的细胞团块，加8ml dmem+10%fbs终止消化，轻柔吹打。
（2）然后将液体转移到15ml塑料离心管中，静置10-15min，吸弃上清，加2mles培养液。
（3）将滴管在酒精灯下拉成非常细的玻璃管，吹打1－2次，尽量将es吹散
（4）将前一天铺好的sto的培养液吸弃，换成10ml的es培养液（操作要小心，不然sto很容易脱落），再把塑料离心管中的es1:3或1:4(视情况而定)传到铺好的sto皿中，前后左右垂直晃动几下，使干细胞分布均匀，置于培养箱中，每天换液，两到三天传代。
应该注意的问题：
1.sto不管是在es传代是换液过程中都可能因为加液体速度过快而脱落，所以最hao靠近培养皿壁先一滴一滴加，避免液体直接打在sto上。
2.玻璃管拉得尽量细一些。
3.一定要把mitomycin洗干净
智立中特（武汉）生物科技有限公司主要致力于质粒微生物资源的保护、共享和持续利用，围绕我国生命科学研究、生物技术创新和产业发展等重大需求，探索、发现、收集国内外的微生物资源，妥善长期保存管理；在保证生物安全和保护知识产权的前提下，为工农业生产、卫生健康、环境保护、科研教育提供质粒载体物物种资源、基因资源、信息资源和专业技术服务。旗下质粒载体网是一款提供质粒载体展示及定制的专业型网站，由智立中特（武汉）生物科技有限公司联合多家企业公司科研院校共同打造！主要展示了各种基因类型下的质粒载体！
我们的工作主要包括：广泛分离、收集、保藏、交换和供应各类微生物质粒菌种；保存用于专li程序的各种可培养生物材料；质粒载体类保藏技术研究；微生物分离、培养技术研究；微生物鉴定和复核技术研究；保藏菌种的资料情报收集和提供及编辑微生物菌种目录。
目前保存各类载体资源超过20000余种，质粒微生物约5000株，另外我们还代理国外微生物菌种资源，如addgene，安捷伦，thermo，atcc等。
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1.饲养层细胞sto处理：当sto铺满平皿后，向培养液中加入100ul 1mg/mlmitomycinc(toxic,操作时不要接触，作用是抑制sto增殖)，轻轻摇晃平皿，保证分布均匀，放置于培养箱中处理2h后，吸弃培养液，10mlpbs洗两遍（目的是把mitomycinc洗净），0.25%胰mei消化，5ml(dmem+10%fbs)终止，离心1000rpm*5min弃上清，加dmem+10%fbs后吹打均匀，种到新的100mm细胞培养皿，补齐培养液至10ml。置于培养箱中过夜。
2.第二天早上传干细胞：
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（2）然后将液体转移到15ml塑料离心管中，静置10-15min，吸弃上清，加2mles培养液。
（3）将滴管在酒精灯下拉成非常细的玻璃管，吹打1－2次，尽量将es吹散
（4）将前一天铺好的sto的培养液吸弃，换成10ml的es培养液（操作要小心，不然sto很容易脱落），再把塑料离心管中的es1:3或1:4(视情况而定)传到铺好的sto皿中，前后左右垂直晃动几下，使干细胞分布均匀，置于培养箱中，每天换液，两到三天传代。
应该注意的问题：
1.sto不管是在es传代是换液过程中都可能因为加液体速度过快而脱落，所以最hao靠近培养皿壁先一滴一滴加，避免液体直接打在sto上。
2.玻璃管拉得尽量细一些。
3.一定要把mitomycin洗干净
智立中特（武汉）生物科技有限公司主要致力于质粒微生物资源的保护、共享和持续利用，围绕我国生命科学研究、生物技术创新和产业发展等重大需求，探索、发现、收集国内外的微生物资源，妥善长期保存管理；在保证生物安全和保护知识产权的前提下，为工农业生产、卫生健康、环境保护、科研教育提供质粒载体物物种资源、基因资源、信息资源和专业技术服务。旗下质粒载体网是一款提供质粒载体展示及定制的专业型网站，由智立中特（武汉）生物科技有限公司联合多家企业公司科研院校共同打造！主要展示了各种基因类型下的质粒载体！
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