分子克隆技巧简介
分子克隆是分子生物学中用于组装重组dna分子的一组实验方法。
基于质粒的克隆包括 4 个主要步骤：
插入 dna 制备
载体dna制备
插入片段与载体的连接
转化为感受态细胞
在下面的示例中，我们将描述如何使用 sgfi 和 mlui 将目标插入片段亚克隆到载体中。
插入 dna 制备对含有插入片段的载体进行限制性消化
用相应的限制性内切酶消化含有插入片段的载体 dna。对于我们的示例，使用的限制性位点是 sgfi 和 mlui 位点。 origene 拥有全基因组 cdna 表达载体。
在琼脂糖凝胶上运行消化的插入 dna 以检查大小并进行凝胶内纯化。oti-tip：在琼脂糖凝胶上运行纯化的消化插入片段以确认浓度。浓度将进一步有助于建立连接。
从模板进行 pcr 扩增如果无法用兼容的限制性位点切割插入片段，则可以使用 pcr 来扩增插入片段，使其具有目标序列侧翼的所需克隆位点。
设计包含目标序列侧翼所需克隆位点的引物。免费的在线软件程序可用于设计引物。如果手动设计，我们建议最小长度约为20bp，gc含量为40-60%，tm为60-65°c。
通过 pcr 扩增模板中的插入 dna。使用 pcr 纯化试剂盒纯化产物。
用限制性内切酶消化 pcr 产物。在琼脂糖凝胶上运行消化的 pcr 并纯化正确大小的 pcr 带。oti-tip：在琼脂糖凝胶上运行纯化的 pcr 插入片段以确认浓度。浓度将进一步有助于建立连接。
载体dna制备选择适合您的包含多个克隆位点 (mcs) 的克隆载体。 origene 拥有超过120 种哺乳动物表达载体，包括病毒和非病毒形式。如果需要更多的载体dna，可以使用热休克或电穿孔方法转化至大肠杆菌感受态细胞，例如dh5 alpha。
用与插入序列（例如 sgfi 和 mlui 位点）兼容的限制性酶消化 3-5 ug 载体。将限制性消化酶在 37°c 下孵育 1 小时。oti-tip：可能需要更长的孵育时间以确保载体全消化，但不要超过 3 小时。oti-tip：为防止载体自连接，请用碱性磷酸酶在 37°c 下将消化载体的 5' 末端去磷酸化 30 分钟。
为了减少未切割的载体质粒背景，我们建议在琼脂糖凝胶上运行消化的载体，然后纯化线性载体。oti-tip：在琼脂糖凝胶上运行纯化的消化载体以确认浓度。浓度将进一步有助于建立连接。
结扎为了成功连接，您可以使用载体：插入片段摩尔比为 1:3。oti-tip：1:1 和 1:10 之间的载体：插入片段比例也可用于进一步优化连接反应。
要确定自连接产生的任何背景克隆，请设置不含插入 dna 的对照连接。
在 16 oc 下孵育过夜（或根据连接试剂盒中的方案）。
转型通过电穿孔或热休克方法将 1-2 ul 连接反应转化至大肠杆菌感受态细胞中。oti-tip：如果插入片段有毒或不稳定，则可以使用专门允许这些插入片段成功扩增的感受态细胞。
转移至 soc 培养基中以复活转化的细胞。在 37°c 下搅拌 soc 介质 1-2 小时。
将混合物接种到装有抗生素平板的 lb 上，并在 37°c 下孵育过夜。oti-tip：对于某些有毒插入物，可能需要较低的温度和较长的孵育时间。较小的菌落可能是正确的克隆。
筛选带有目标插入序列的质粒的集落。通过消化、pcr 扩增和测序确认
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为了减少未切割的载体质粒背景，我们建议在琼脂糖凝胶上运行消化的载体，然后纯化线性载体。oti-tip：在琼脂糖凝胶上运行纯化的消化载体以确认浓度。浓度将进一步有助于建立连接。
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