LncRNAFER1L4通过AKT/FOXO3通路介导牙周膜干细胞自噬
正畸牙齿移动是通过施加机械力来实现的，然后是牙周组织重塑和再生。牙齿将力传递到牙周膜，牙周膜将力分布与牙槽骨，牙槽骨发生组织改建产生牙移动。牙周膜干细胞（pdlscs）是介导正畸力转导和牙周组织重塑的机械敏感细胞。进一步研究pdlscs对正畸力的反应并更好地了解这种机制对于改善正畸治疗方法至关重要。
自噬是一种基本的细胞内过程，介导细胞器降解和再循环以维持细胞稳态。先前的研究表明，自噬在专门的机械敏感细胞中起到机械适应作用。它在髓核细胞中增加以响应压缩力刺激，但在足细胞中减少。然而，在正畸压缩力的作用下，自噬在牙周膜中的作用仍然在很大程度上是未知的。研究初步发现，在生物力学负荷下，牙周膜成纤维细胞的自噬增加。然而，在牙齿移动过程中，自噬在压缩区域受到调节的确切机制尚不清楚。
长链非编码rnas（lncrnas）是长度大于200个核苷酸的转录本，成为自噬领域的关键调节因子。研究表明，lncrnas通过调节自噬参与各种细胞途径，包括缺血和再灌注损伤，肿瘤发生，心血管疾病和糖尿病等。fer-1样家族成员4（fer1l4）是一种新发现的 lncrna，已被证明与某些类型的癌症有关，包括肺癌、肝细胞癌、骨肉瘤和子宫内膜癌。然而，还没有研究调查fer1l4在自噬中的功能和机制。
因此，北京大学口腔医学院正畸科、口腔数字化医疗技术和材料国家工程实验室研究团队曾探讨了pdlscs在压缩力下的自噬活性，并进一步确定lncrna fer1l4对pdlscs在机械应力下的自噬是否重要，如果重要，潜在的机制是什么。
压缩力作用下pdlscs中自噬被诱导
将牙周膜干细胞暴露于静态压缩力下（2 g/cm2）12小时（图1 a）。cck-8测定显示，有或没有压缩力组细胞增殖相似（图1 b）。流式细胞术分析也证实，与对照组相比，压缩力组的细胞凋亡和坏死无显著差异（图1 c）。进一步测定自噬活性。自噬的两种生物标志物lc3 ii/i和beclin1的表达水平在压缩力组中较高（图1 d）。在荧光显微镜下自噬体以多个明亮的绿色荧光斑点存在。压缩力组lc3呈点状分布，在核周和细胞质区域周围始终显著（图1 e）。tem也用于检测自噬流。自噬体定义为pdlscs细胞质中含有细胞碎片或降解细胞器的双膜囊泡，在压缩力组中增加（图1 f）。为了确定自噬的作用，用自噬抑制剂氯喹（10 μm）处理pdlscs。结果表明，抑制自噬流后凋亡细胞显著增加（图1 g）。当用自噬抑制剂预处理细胞时，轻度压缩力（2 g/cm2）诱导显著的细胞凋亡（图1 h）。
图1 pdlscs在压缩作用下的自噬增加。将细胞施加静态压缩力12小时。
lncrna fer1l4在受压缩力作用的pdlscs中显著上调
先前的rna测序原始数据显示，在压缩力作用下，pdlscs中的fer1l4显著增加（约7倍）。为了进一步研究fer1l4的作用，使用fish技术在荧光显微镜下观察fer1l4的分布。结果表明，fer1l4位于细胞核和细胞质中。静态压缩力刺激后，细胞核和细胞质中fer1l4的强度均增加。
fer1l4介导由压缩力诱导的pdlscs的自噬
为了研究fer1l4在pdlscs自噬调节中的作用，实验进行了功能获得和功能丧失测定。pqll-fer1l4质粒转染组fer1l4表达显著升高，sifer1l4转染组fer1l4表达显著降低（图2 a）。
用pqll-fer1l4载体转染后，蛋白质印迹分析显示，自噬标志物lc3 ii/i和beclin1的蛋白表达上调（图2 b）。共聚焦显微镜下fer1l4过表达组lc3点状的细胞质形成显著增加，表明自噬体形成显著增加（图2 c）。tem进一步证实了自噬体和自噬溶酶体的形成。转染fer1l4载体后，pdlscs细胞质中的自噬体和自噬溶酶体数量增加（图2 d）。
为了确定fer1l4是否介导pdlscs在压缩力下的自噬，用sifer1l4预转染细胞，然后暴露于机械应力12小时，结果表明，通过敲低fer1l4，机械应力诱导的lc3 ii/i和beclin1表达均被消除（图2 e）。
图2 fer1l4促进pdlscs的自噬水平。
fer1l4在施加外部压缩力期间通过akt/foxo3信号通路调节自噬
akt信号通路在自噬的负调控中很重要。为了研究fer1l4是否调节pdlscs中的akt信号通路，实验进行了蛋白质印迹分析，结果表明，fer1l4过表达抑制了akt（p-akt）的磷酸化，而akt总量几乎保持不变（图3 a）。伴随p-akt的降低，观察到p-foxo3的显著降低和foxo3表达的增加（图3 a）。免疫荧光测定也检测了foxo3蛋白的定位。fer1l4过表达组foxo3免疫染色较强（图3 b）。而在fer1l4敲低细胞中，akt的磷酸化和foxo3的磷酸化上调，foxo3的表达下调（图3 c）。免疫染色也显示 fer1l4 敲低组 foxo3 的荧光染色相对较弱（图3 d）。
为了进一步确定fer1l4是否通过akt/foxo3信号通路介导压缩力下pdlscs的自噬，实验随后研究了在施加压缩力期间该通路的激活情况。基于 kegg 数据库对先前rna测序数据的通路分析表明，机械应力显著影响pi3k/akt信号通路。一致地，暴露于压缩力的pdlscs中p-akt和p-foxo3显著降低，而foxo3的核易位增加。然而，当细胞用sifer1l4预转染时，敲低fer1l4后，压缩力引起的p-akt和p-foxo3的抑制作用和foxo3的激活作用均消失。
图3 fer1l4抑制akt的磷酸化，增加foxo3的核易位。
fer1l4和自噬标志物在正畸牙压缩牙周膜中的表达上调
为了确定fer1l4和自噬在牙周膜对正畸力的反应中的功能，实验使用了小鼠正畸牙齿移动模型。fish检测显示，fer1l4 rna的荧光染色强度在牙周膜的压缩区显著诱导，而对照组牙周膜的荧光强度较低。此外，还确定了正畸牙齿受压力下牙周膜中的自噬。免疫组织化学染色显示，在应用正畸加压的区域，自噬标志物lc3的活性增加。
图4 fer1l4通过akt/foxo3通路介导正畸压缩力作用下牙周膜干细胞自噬的示意图。
综上所述，该研究表明，正畸压缩力诱导牙周膜干细胞自噬，lncrna fer1l4通过akt/foxo3通路介导压缩力作用下自噬的激活（图4）。这些发现表明了lncrna在正畸牙齿移动的牙周组织重塑过程中自噬调控的机制。
参考文献：huang y, liu h, guo r, han y, yang y, zhao y, zheng y, jia l, li w. long non-coding rna fer1l4 mediates the autophagy of periodontal ligament stem cells under orthodontic compressive force via akt/foxo3 pathway. front cell dev biol. 2021 feb 2;9:631181. doi: 10.3389/fcell.2021.631181. pmid: 33604341; pmcid: pmc7884613.
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因此，北京大学口腔医学院正畸科、口腔数字化医疗技术和材料国家工程实验室研究团队曾探讨了pdlscs在压缩力下的自噬活性，并进一步确定lncrna fer1l4对pdlscs在机械应力下的自噬是否重要，如果重要，潜在的机制是什么。
压缩力作用下pdlscs中自噬被诱导
将牙周膜干细胞暴露于静态压缩力下（2 g/cm2）12小时（图1 a）。cck-8测定显示，有或没有压缩力组细胞增殖相似（图1 b）。流式细胞术分析也证实，与对照组相比，压缩力组的细胞凋亡和坏死无显著差异（图1 c）。进一步测定自噬活性。自噬的两种生物标志物lc3 ii/i和beclin1的表达水平在压缩力组中较高（图1 d）。在荧光显微镜下自噬体以多个明亮的绿色荧光斑点存在。压缩力组lc3呈点状分布，在核周和细胞质区域周围始终显著（图1 e）。tem也用于检测自噬流。自噬体定义为pdlscs细胞质中含有细胞碎片或降解细胞器的双膜囊泡，在压缩力组中增加（图1 f）。为了确定自噬的作用，用自噬抑制剂氯喹（10 μm）处理pdlscs。结果表明，抑制自噬流后凋亡细胞显著增加（图1 g）。当用自噬抑制剂预处理细胞时，轻度压缩力（2 g/cm2）诱导显著的细胞凋亡（图1 h）。
图1 pdlscs在压缩作用下的自噬增加。将细胞施加静态压缩力12小时。
lncrna fer1l4在受压缩力作用的pdlscs中显著上调
先前的rna测序原始数据显示，在压缩力作用下，pdlscs中的fer1l4显著增加（约7倍）。为了进一步研究fer1l4的作用，使用fish技术在荧光显微镜下观察fer1l4的分布。结果表明，fer1l4位于细胞核和细胞质中。静态压缩力刺激后，细胞核和细胞质中fer1l4的强度均增加。
fer1l4介导由压缩力诱导的pdlscs的自噬
为了研究fer1l4在pdlscs自噬调节中的作用，实验进行了功能获得和功能丧失测定。pqll-fer1l4质粒转染组fer1l4表达显著升高，sifer1l4转染组fer1l4表达显著降低（图2 a）。
用pqll-fer1l4载体转染后，蛋白质印迹分析显示，自噬标志物lc3 ii/i和beclin1的蛋白表达上调（图2 b）。共聚焦显微镜下fer1l4过表达组lc3点状的细胞质形成显著增加，表明自噬体形成显著增加（图2 c）。tem进一步证实了自噬体和自噬溶酶体的形成。转染fer1l4载体后，pdlscs细胞质中的自噬体和自噬溶酶体数量增加（图2 d）。
为了确定fer1l4是否介导pdlscs在压缩力下的自噬，用sifer1l4预转染细胞，然后暴露于机械应力12小时，结果表明，通过敲低fer1l4，机械应力诱导的lc3 ii/i和beclin1表达均被消除（图2 e）。
图2 fer1l4促进pdlscs的自噬水平。
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akt信号通路在自噬的负调控中很重要。为了研究fer1l4是否调节pdlscs中的akt信号通路，实验进行了蛋白质印迹分析，结果表明，fer1l4过表达抑制了akt（p-akt）的磷酸化，而akt总量几乎保持不变（图3 a）。伴随p-akt的降低，观察到p-foxo3的显著降低和foxo3表达的增加（图3 a）。免疫荧光测定也检测了foxo3蛋白的定位。fer1l4过表达组foxo3免疫染色较强（图3 b）。而在fer1l4敲低细胞中，akt的磷酸化和foxo3的磷酸化上调，foxo3的表达下调（图3 c）。免疫染色也显示 fer1l4 敲低组 foxo3 的荧光染色相对较弱（图3 d）。
为了进一步确定fer1l4是否通过akt/foxo3信号通路介导压缩力下pdlscs的自噬，实验随后研究了在施加压缩力期间该通路的激活情况。基于 kegg 数据库对先前rna测序数据的通路分析表明，机械应力显著影响pi3k/akt信号通路。一致地，暴露于压缩力的pdlscs中p-akt和p-foxo3显著降低，而foxo3的核易位增加。然而，当细胞用sifer1l4预转染时，敲低fer1l4后，压缩力引起的p-akt和p-foxo3的抑制作用和foxo3的激活作用均消失。
图3 fer1l4抑制akt的磷酸化，增加foxo3的核易位。
fer1l4和自噬标志物在正畸牙压缩牙周膜中的表达上调
为了确定fer1l4和自噬在牙周膜对正畸力的反应中的功能，实验使用了小鼠正畸牙齿移动模型。fish检测显示，fer1l4 rna的荧光染色强度在牙周膜的压缩区显著诱导，而对照组牙周膜的荧光强度较低。此外，还确定了正畸牙齿受压力下牙周膜中的自噬。免疫组织化学染色显示，在应用正畸加压的区域，自噬标志物lc3的活性增加。
图4 fer1l4通过akt/foxo3通路介导正畸压缩力作用下牙周膜干细胞自噬的示意图。
综上所述，该研究表明，正畸压缩力诱导牙周膜干细胞自噬，lncrna fer1l4通过akt/foxo3通路介导压缩力作用下自噬的激活（图4）。这些发现表明了lncrna在正畸牙齿移动的牙周组织重塑过程中自噬调控的机制。
参考文献：huang y, liu h, guo r, han y, yang y, zhao y, zheng y, jia l, li w. long non-coding rna fer1l4 mediates the autophagy of periodontal ligament stem cells under orthodontic compressive force via akt/foxo3 pathway. front cell dev biol. 2021 feb 2;9:631181. doi: 10.3389/fcell.2021.631181. pmid: 33604341; pmcid: pmc7884613.
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