酶切体系的建立
酶 切 反 应
(setting up a restriction endonuclease reaction)
一、 建立一个标准的酶切反应
目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的dna。通常，一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1x nebuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的dna。如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16小时）也可*反应。
二、 选择正确的酶
不言而喻，选择的酶在底物dna上必须至少有一个相应的识别位点。识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物。假设一个gc含量50%的dna链，一个识别4个碱基的酶将平均在每44（256）个碱基中切割一次；而一个识别6个碱基的酶将平均在每46（4096）碱基切割一次。内切酶的产物可以是粘端的（3''或5''突出端），也可以是平端的片段。粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接。相关信息参见目录的compatible cohesive ends and recleavable blunt ends一文。
三、 酶
内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。酶应当是*后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。酶的用量视在底物上的切割频率而定。例如，超螺旋和包埋法切割的dna通常需要超过1u/μg的酶才能被*切割。参见目录第244和264之切割质粒dna和包埋法切割dna。
四、 dna
待切割的dna应当已去除酚、乙醇、edta、去污剂或过多盐离子的污染，以免干扰酶的活性。dna的甲基化也应该是酶切要考虑到的因素。关于甲基化的内容，参见第252页至253页之甲基化相关内容。
五、 缓冲液
对于每一种酶neb都提供相应的*佳缓冲液，可保证几乎100%的酶活性。使用时的缓冲液浓度应为1x。有的酶要求100μg/ml的bsa以实现*佳活性。在这种情况下，我们也相应提供100x的bsa（10mg/ml）。不需要bsa的酶如果加了bsa也不会受太大影响。关于缓冲液更详细的信息参见第234页。
六、 反应体积
内切酶活力单位的定义是：1小时内，50μl反应体积中，降解1μg的底物dna所需的酶为一个活力单位。因此酶：dna的反应比例可以由此确定。较小的反应体积更容易受到移液器误差的影响。为了将甘油的浓度控制在5%以下，要注意酶的体积不要超过总体积的10%（一般酶都贮存于50%的甘油中）。
七、 混合
这是非常重要然而常常被忽略的一步。想要反应*，必须使反应液充分混合。我们*用枪反复吸取混合，或是用手指轻弹管壁混合，然后再快速离心一下即可。注意：不可振荡！
八、 反应温度
大部分酶的反应温度为37°c；从嗜热菌中分离出来的内切酶则要求更高的温度。一般为50-65°c不等。参看第244页 activity of thermophiles at 37°c。
九、 反应时间
1酶活单位的定义时间为1小时。如果加入的酶较多，可以相应地缩短反应时间；反之，如果加入的酶量较少，也可以延长时间以使反应达到*。参见第241页酶在反应中的存活时间。
十、 终止反应
如果不进行下一步酶切反应，可用终止液来终止反应。在neb我们使用如下反应终止液：50%的甘油，50mm edta（ph8.0），和0.05%溴酚蓝（10μl/50μl反应液）。如果要进行下一步酶切反应，可用热失活法终止反应（65°c或85°c，20分钟）。热失活并不能适用于所有的酶，详情参见第240页热失活表。此外，抽提也可以用于终止反应。
十一、贮存
大部分酶应贮存于-20°c。少部分酶则须在-70°c*保存。详情请参见相关酶的data sheet 或目录相关部分。10x buffer 和100x bsa于-20°c保存。bsa不能与nebuffer混合后保存，否则将会出现bsa沉淀。
十二、稳定性
每隔1-2个月都会对所有的酶有一个活性检测；*近的一次检测结果将被贴在售出的每一管酶上。通过三十多年来的经验，我们发现大部分酶在*的保存缓冲液里在-20°c条件下十分稳定。高于-20°c条件下稳定性将有所降低。
十三、对照反应
如果发现您的dna底物不能被成功切开，可以进行对照实验以查明原因。具体方法如下：
将不加内切酶的底物dna（待切底物）与加入了内切酶的对照dna（有多个已知酶切位点）同时进行反应。若实验结果表明底物dna降解，则说明dna在纯化过程中或反应液里引入了核酸酶污染；若实验结果发现底物dna保持完整，而对照dna被成功切开，则可以排除酶质量的原因，此时可以将对照dna和待切底物dna混合起来再次进行反应，以确定样品中是否有抑制剂。如果有抑制剂存在（通常是盐、edta或酚），则混合物里的对照dna也无法被切开。
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目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的dna。通常，一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1x nebuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的dna。如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16小时）也可*反应。
二、 选择正确的酶
不言而喻，选择的酶在底物dna上必须至少有一个相应的识别位点。识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物。假设一个gc含量50%的dna链，一个识别4个碱基的酶将平均在每44（256）个碱基中切割一次；而一个识别6个碱基的酶将平均在每46（4096）碱基切割一次。内切酶的产物可以是粘端的（3''或5''突出端），也可以是平端的片段。粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接。相关信息参见目录的compatible cohesive ends and recleavable blunt ends一文。
三、 酶
内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。酶应当是*后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。酶的用量视在底物上的切割频率而定。例如，超螺旋和包埋法切割的dna通常需要超过1u/μg的酶才能被*切割。参见目录第244和264之切割质粒dna和包埋法切割dna。
四、 dna
待切割的dna应当已去除酚、乙醇、edta、去污剂或过多盐离子的污染，以免干扰酶的活性。dna的甲基化也应该是酶切要考虑到的因素。关于甲基化的内容，参见第252页至253页之甲基化相关内容。
五、 缓冲液
对于每一种酶neb都提供相应的*佳缓冲液，可保证几乎100%的酶活性。使用时的缓冲液浓度应为1x。有的酶要求100μg/ml的bsa以实现*佳活性。在这种情况下，我们也相应提供100x的bsa（10mg/ml）。不需要bsa的酶如果加了bsa也不会受太大影响。关于缓冲液更详细的信息参见第234页。
六、 反应体积
内切酶活力单位的定义是：1小时内，50μl反应体积中，降解1μg的底物dna所需的酶为一个活力单位。因此酶：dna的反应比例可以由此确定。较小的反应体积更容易受到移液器误差的影响。为了将甘油的浓度控制在5%以下，要注意酶的体积不要超过总体积的10%（一般酶都贮存于50%的甘油中）。
七、 混合
这是非常重要然而常常被忽略的一步。想要反应*，必须使反应液充分混合。我们*用枪反复吸取混合，或是用手指轻弹管壁混合，然后再快速离心一下即可。注意：不可振荡！
八、 反应温度
大部分酶的反应温度为37°c；从嗜热菌中分离出来的内切酶则要求更高的温度。一般为50-65°c不等。参看第244页 activity of thermophiles at 37°c。
九、 反应时间
1酶活单位的定义时间为1小时。如果加入的酶较多，可以相应地缩短反应时间；反之，如果加入的酶量较少，也可以延长时间以使反应达到*。参见第241页酶在反应中的存活时间。
十、 终止反应
如果不进行下一步酶切反应，可用终止液来终止反应。在neb我们使用如下反应终止液：50%的甘油，50mm edta（ph8.0），和0.05%溴酚蓝（10μl/50μl反应液）。如果要进行下一步酶切反应，可用热失活法终止反应（65°c或85°c，20分钟）。热失活并不能适用于所有的酶，详情参见第240页热失活表。此外，抽提也可以用于终止反应。
十一、贮存
大部分酶应贮存于-20°c。少部分酶则须在-70°c*保存。详情请参见相关酶的data sheet 或目录相关部分。10x buffer 和100x bsa于-20°c保存。bsa不能与nebuffer混合后保存，否则将会出现bsa沉淀。
十二、稳定性
每隔1-2个月都会对所有的酶有一个活性检测；*近的一次检测结果将被贴在售出的每一管酶上。通过三十多年来的经验，我们发现大部分酶在*的保存缓冲液里在-20°c条件下十分稳定。高于-20°c条件下稳定性将有所降低。
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