液质联用在蛋白质药物糖基化分析中的应用
糖基化对蛋白药物的疗效，稳定性，免疫 原性具有重要点影响。以单克隆抗体为例， 常见的n-糖型主要为g0f、g1f、g2f、g1fglcnac、g0f-glcnac等；如果出现oligoman、 gal-a-1,3-gal、ngna、xyl-1,2 fuc-1,3等糖型， 则会影响免疫原性或半衰期，需要避免；另 一方面，可以细胞工程及分子生物学技术， 提高a-fuc，glcnac bisecting，g2f， hyper sialyation(nana)的含量，以增强adcc，cdc， anti-inflammatory 等效能。寡糖为非模板合成， 并呈树状结构，其结构极其复杂，仅由6种单 糖组成的寡糖链，其理论结构即达到惊人的 1012种。这就要求用于寡糖的分析设备具有强 悍的分析性能。thermo fisher开发了一系列简单、的液相色谱-质谱表征方法，涵盖 了从糖链结构分析、到糖基化位点鉴定、再 到糖肽解析的完整分析流程（图2）。
一、寡糖链分析 n-糖链（由天冬酰胺连接寡糖）结构分析 包括寡糖链释放、标记、液质联用分析和数 据处理四个步骤（图2）[1] 。寡糖链释放根据 不同的糖基化类型选择不同的方法，n-糖链主 要使用pngase f。衍生化标记步骤可以增强寡 糖的质谱响应。其中，还原末端标记2-ab等苯 胺或杂环化合物还可使寡糖链通过荧光检测， 全甲基化标记增强寡糖链的疏水性，实现反 相分离检测。以q-exactive为代表的orbitrap超
高分辨质谱具有高的灵敏度优势，使用其直 接分析未标记的糖链也可以取得满意的效果。 寡糖碎片质谱可使用simglycantm软件进行全 自动结构解析，获得寡糖链精细结构信息。在寡糖色谱分析中，专门为寡糖分离设计 的glycanpac axh-1/axr-1色谱柱，结合了弱阴 离子交换wax和亲水相互作用hilic (axh-1)/反 相rp (axr-1)两种保留机理，能够率地分 析复杂寡糖链混合样本。经典的hilic/rp机理 可以根据电荷数、极性、大小实现寡糖链分 离，而wax机理保留和选择带负电荷的寡糖 链，对含唾液酸的寡糖链具有很好的分离效 果。使用glycanpac色谱柱分析2-ab标记的牛 胎球蛋白(bovine fetuin) n-糖链，结果表明寡 糖链得到有效分离，特别是对含有唾液酸的寡糖的分离效果良好（图3a）。即使分析未 标记的天然牛胎球蛋白n-糖链（图3b），仍 然获得了理想的分离效果[2,3] 。
以 q-exactive 为代表的静电场轨道阱 orbitrap具有10万以上的超高分辨率和amol级 的超高灵敏度，结合高能碎裂(hcd)模式，能 获得丰富的碎片信息，并分辨和检测寡 糖。通过牛胎球蛋白三天线复杂型n-糖链的二 级质谱分析（图4a）可以看出，即使是寡糖链没有被标记，谱图仍然获得了丰富的高强 度碎片信号，特别是b/y、c/z等跨环断裂信息， 对寡糖链精细结构的解析具有重要作用。实 验在牛胎球蛋白中成功解析了29种不同结构 的n-糖链（图4b），其中绝大部分为含唾液 酸的寡糖链，证明uhplc-orbitrap对复杂寡糖 链的强大分析能力 [4] 。 glycanpac 色谱与 orbitrap结合还实现了仅糖苷键/构象不同的同
专业糖链结构解析软件simglycantm可实现 对复杂寡糖链谱图的全自动解析。将实验获 得的寡糖链数据与内置数据库中寡糖链的理 论碎片谱图匹配，分别获得糖苷键断裂、双 糖苷键断裂、跨环断裂、跨环断裂+糖苷键断 裂的匹配率（图6），进而计算得到寡糖链的 结构解析结果[6] 。此外，还可以利用线性离子阱质量分析器 的多级功能(msn)，对同分异构寡糖链进行多级碎裂和检测，获得单糖构象、糖苷键连接 等精细结构的更多差异信息，从多角度实现 同分异构寡糖链的结构解析和分辨[7] 。
二、糖基化位点分析 n-糖基化位点鉴定通常使用pngase f 酶释 放糖链，使肽段上产生去糖基化位点，并在 肽段上产生去糖基化痕迹：天冬酰胺(n)发生 脱氨基化，造成0.9840 da的质量增加。通过 质谱寻找发生+0.9840 da的天冬酰胺，以及n- 糖基化保守序列nxs/t (x代表*以外的任 何氨基酸)过滤，获得可信的鉴定结果（图8）。 为了避免天然脱氨基化造成的假阳性，可以在18o水中进行酶切，使去糖基化位点含有一 个18o，形成+2.9890da，可与天然脱氨基区分。
糖基化位点的发现与确证对质谱的分辨 率与灵敏度具有较高要求。orbitrap由于具有 超高分辨率和超高灵敏度，无论对于单抗等 纯蛋白样品、还是全细胞蛋白等复杂样品， 都是是糖基化位点表征的工具。目前糖 基化位点大的数据集，共从小鼠组织与血 浆中注释了6367个糖基化位点[8] 。该实验采用 用pngase f 释放糖链并标记18o方法，使用 orbitrap鉴定糖基化位点，共鉴定到6367个位点，其中5753个位点是没有记载的新位点。 该研究对糖蛋白的研究具有重要意义（图9）， 也展示出了orbitrap超群的性能。在相对简单 的抗体及其他蛋白药物糖基化位点表征中， orbitrap更可毫无疑问地胜任此工作[9] 。
三、糖肽分析 糖肽分析前处理简单，能同时鉴定糖基化 位点和解析寡糖链结构，并获得位点特异性 糖链信息，即微观不均一性。但是糖肽解析 比糖链与糖肽分开解析的传统方法更为复杂： 寡糖链离子化效率较低；相比肽段骨架更易 碎裂，造成肽段骨架难以充分碎裂；谱图非 常复杂，传统搜库手段。hcd高能碎 裂相比传统cid能获得更丰富的碎片信息，使 糖肽的寡糖链和肽段骨架充分碎裂。orbitrap
超高分辨质量分析器能有效分辨糖肽产生的 复杂碎片，避免碎片离子间的相互干扰，提 高离子化效率较低的寡糖碎片响应。byonictm 可以实现复杂糖肽谱图的全自动数据处理， 解析肽段骨架序列和寡糖链结构。
单抗药物利妥昔(rituximab)经trypsin酶切 后，使用q-exactive在线分析，碎裂模式为 hcd，并使用byonictm解析谱图。图10展示了 糖肽eeqynstyr的谱图解析结果，谱图中存在 着丰富的糖肽碎片离子，并获得超高质量精 度的可靠匹配，确定糖链结构为g0f。特别是 低分子量端的单糖和寡糖碎片，能够作为诊 断离子，进一步确证糖肽解析结果[10,11] 。
融合蛋白药物通常为糖蛋白，其糖基化 比单抗更为复杂。单抗寡糖链结构已研究的 较为透彻，但融合蛋白存在诸多未知寡糖链，这类糖肽的解析普通液质难以胜任。orbitrap 超高分辨率、超高质量精度和灵敏度为未知 糖肽解析提供了有效解决方案。实验使用 orbitrap对高度糖基化的一种fc融合蛋白药物 进行了完整糖肽解析。该融合蛋白同时含有 多个n-糖和o-糖位点，寡糖链结构未知。以糖 肽tkpreeqynstyr解析结果为例（图11）， hcd谱图同时获得了丰富的寡糖链碎片和肽段 骨架碎片，使用byonictm得到可靠鉴定结果 （图11a）。由于寡糖链存在诸多同分异构体， 因此实验进一步使用了simglycantm确证寡糖 链结构，该寡糖链结构确证为三链高甘露糖 型 （ 图 11b ） 。 解析结果汇总表明 ， 仅 tkpreeqynstyr上n317一个位点，就有15种 结构各异的寡糖链（图11c）。实验共获得2 个n-糖基化位点、16个o-糖基化位点，83种 位点特异的寡糖链结构，为该融合蛋白的研 究和申报提供了重要表征信息[12] 。
orbitrap质量分析器与hcd高能碎裂能有 效应对复杂未知糖肽解析的挑战。对于一些 仍无法解析的情况，还可以利用多级裂 解msn获得寡糖链精细结构，或通过电子传递 裂解etd得到更多肽段骨架碎裂，获得与hcd 互补的结构信息[12-16] 。
四、etd与o-linked糖肽分析 o-linked糖基化，主要发生在*（s） 与*（t）残基。在对o-linked糖基化进 行位点分析时，会遇到较n-linked糖基化更大 的困难。一方面，o-linked糖基化分析中，缺 乏像n-linked糖基化分析里使用的pngases f糖
苷酶，而难以进行去糖基化位点质量标记。 另一方面。在多肽序列中，s与t经常密集出现， 如果使用常规的碰撞诱导解离（cid）方法， 糖苷键将成为主要的断裂碎片，因此难于获 得丰富的肽段碎片信息，导致序列及o-linked 糖基化位点分析困难。因此o-linked糖基化分 析需要使用到etd（电子传递解离）技术。etd优先断裂肽段骨架，避免了寡糖链的碎裂， 能为o-糖肽提供有效信息。通过etd分析人血 清富*糖蛋白（hrg）t271-284肽段的两 种不同寡糖链结构的o-糖肽，获得了丰富的 肽段骨架碎片信息（c/z系列离子），而寡糖 链得以有效保留，降低了谱图复杂性，有利 于糖基化位点与结构解析（图12）[17] 。
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二、糖基化位点分析 n-糖基化位点鉴定通常使用pngase f 酶释 放糖链，使肽段上产生去糖基化位点，并在 肽段上产生去糖基化痕迹：天冬酰胺(n)发生 脱氨基化，造成0.9840 da的质量增加。通过 质谱寻找发生+0.9840 da的天冬酰胺，以及n- 糖基化保守序列nxs/t (x代表*以外的任 何氨基酸)过滤，获得可信的鉴定结果（图8）。 为了避免天然脱氨基化造成的假阳性，可以在18o水中进行酶切，使去糖基化位点含有一 个18o，形成+2.9890da，可与天然脱氨基区分。
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