纯干货！巧用外泌体示踪，探索细胞通讯奥秘！
纯干货！巧用外泌体示踪，探索细胞通讯奥秘！
外泌体，作为细胞间通讯的重要载体，近年来在临床医学精准治疗领域中引起了广泛的关注。外泌体含有丰富的活性物质，可以调控细胞间的信息交流，在药载递送、无细胞治疗、疾病诊断方面具有潜在的技术应用蓝海。
目前可以通过差速离心、过滤、免疫亲和、层析、流式细胞分选、密度梯度离心等多种手段大致分离出不同的细胞外囊泡亚群，再利用外泌体示踪技术追踪外泌体在体内的分布和归宿，以及它们与细胞的相互作用，在细胞治疗领域中具有重要作用。
外泌体示踪方法01荧光染料标记亲脂性染料可以与外泌体的脂质双层膜稳定结合，直接使用荧光染料（如pkh26、pkh67、dapi、dio等）标记外泌体，通过荧光显微镜观察和分析外泌体，染色效果较好，是目前较为常见的示踪方法。
图1.染料标记外泌体染色效果
02核酸标记通过将外泌体表面或内部的核酸（如mirna、sirna等）标记为荧光探针或放射性标记物，利用核酸杂交或放射性测量等技术来追踪外泌体的运输和内部化过程。
03蛋白质标记利用特定的抗体或标记蛋白（如gfp、luciferase等）标记外泌体表面的特定蛋白质，通过免疫荧光染色或酶活性测量等方法来追踪外泌体的位置和内部化情况。例如，外泌体的特定蛋白 cd63 和绿色荧光蛋白 gfp 的表达元件构建成质粒再包装到慢病毒中，随后用此慢病毒感染细胞，使细胞分泌的外泌体带有绿色荧光，如下图2。
图2.用 gfp 标记的外泌体分别与 sh-sy5y、bv2细胞共培养
04磁性标记利用磁性纳米颗粒（如超顺磁性铁氧体颗粒）标记外泌体，通过磁共振成像或磁力测量等技术来追踪外泌体的位置和内部化过程。
图3.uspio标记外泌体的体内核磁共振成像
05放射性标记使用放射性同位素（如99mtc、125i等）标记外泌体，通过放射性测量技术（如放射性计数或正电子发射断层扫描）来追踪外泌体的位置和内部化情况。例如，研究人员用锆 89 ( 89 zr)标记gmp级别外泌体的定量生物分布和药代动力学，如图4。与荧光或生物发光成像相比，放射性核素成像因其对深部组织成像的出色灵敏度和定量测量的潜力而为生物分子治疗的体内跟踪提供了多种优势。
图4.89zr标记外泌体不同注射时间在小鼠和大鼠体内的定量分布
外泌体染料怎么选？01稳定性
选择具有良好稳定性的染料，以确保染料在外泌体内的持久性和可靠性；
02选择性
选择能够特异性地与外泌体结合的染料，以避免与其他细胞或细胞组分结合。
03可观察性
选择能够在所使用的观察技术中产生强烈信号的染料，以确保外泌体的可视化和检测。
04毒性
选择对细胞和外泌体没有或很低毒性的染料，以避免对实验结果的干扰。
常用的外泌体染料包括荧光染料（如dii、dio、pkh67等）和蛋白质标记染料（如cd63、cd81等抗体标记染料）。这些染料可以通过荧光显微镜、流式细胞术和电子显微镜等技术来观察和检测外泌体。pkh可提供长时间的活细胞荧光膜标记，且无明显毒性作用。膜染料pkh67是一种绿色荧光染料，其激发（490 nm）和发射（504 nm）波长与荧光素和fitc相近。pkh26是红色光谱中的荧光染料，其峰值激发（551 nm）和发射（567 nm）波长特性与罗丹明或藻红蛋白（pe）检测通道兼容，并且也可以被488 nm激光激发。目前pkh染料已成功用于体外和体内跟踪实验中标记外泌体和细胞外囊泡。例如，一项研究发现，人脂肪组织源间充质干细胞（adscs）释放的外泌体可以通过荧光染料pkh26进行标记，并且这些标记的外泌体可以释放功能性的neprilysin，从而对肿瘤具有治疗效果。
总的来说，外泌体在临床医学中也有十分光明的应用前景，主要是因为它们含有丰富的生物标志物，可用于监测临床状态，治疗反应，疾病进展等，同时由于它们具有递送生物分子的功能，因此它们还有发展成临床药物递送载体的潜力
产品推荐产品名称
货号
规格
hieff®exosome tracker kit (for red fluorescence)外泌体红色荧光示踪试剂盒
40780es
20 µl
hieff®exosome tracker kit(for green fluorescence)外泌体绿色荧光示踪试剂盒
40781es
20 µl
hieff®quick exosome isolation kit(for cell culture media) 细胞培养上清外泌体快速抽提试剂
41201es
25 ml/50 ml
hieff®serum-free medium(for exosome) 外泌体专用无血清培养基
41210es
50 ml/500ml
hieff®quick exosome isolation kit plus(for cell culture media) 细胞培养上清外泌体快速提取分离试剂盒
41205es
10 t/20t
hieff®quick exosome isolation kit plus(for serum/plasma) 血清/血浆外泌体快速提取分离试剂盒plus
41206es
30 t
hieff®quick exosome isolation kit（for serum/plasma）血清/血浆外泌体快速抽提试剂盒
41202es
30 ml
exosome identification kit for western blot 外泌体鉴定试剂盒
41203es
5 t
文献参考:
[1]busatoa,bonafeder,bontempip,scambii,schiaffinol,benatid,malatestam,sbarbatia,marzolap,mariottir.magneticresonanceimagingofultrasmallsuperparamagneticironoxide-labeledexosomesfromstemcells:anewmethodtoobtainlabeledexosomes.intjnanomedicine.2016jun1;11:2481-90.[2]choih,kimmy,kimdh,yunh,ohbk,kimsb,songih,parkhs,kimse,parkc,choic.quantitativebiodistributionandpharmacokineticsstudyofgmp-gradeexosomeslabeledwith89zrradioisotopeinmiceandrats.pharmaceutics.2022may24;14(6):1118.[3]polancojc,lic,durisicn,sullivanr,götzj.exosomestakenupbyneuronshijacktheendosomalpathwaytospreadtointerconnectedneurons.actaneuropatholcommun.2018feb15;6(1):10.[4]renr,tanxh,zhaojh,zhangqp,zhangxf,mazj,pengyn,liuqb,zhanghy,liyq,her,zhaozq,yixn.bonemarrowmesenchymalstemcell-derivedexosomeuptakeandretrogradetransportcanoccuratperipheralnerveendings.artifcellsnanomedbiotechnol.2019dec;47(1):2918-2929.
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外泌体示踪方法01荧光染料标记亲脂性染料可以与外泌体的脂质双层膜稳定结合，直接使用荧光染料（如pkh26、pkh67、dapi、dio等）标记外泌体，通过荧光显微镜观察和分析外泌体，染色效果较好，是目前较为常见的示踪方法。
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图2.用 gfp 标记的外泌体分别与 sh-sy5y、bv2细胞共培养
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03可观察性
选择能够在所使用的观察技术中产生强烈信号的染料，以确保外泌体的可视化和检测。
04毒性
选择对细胞和外泌体没有或很低毒性的染料，以避免对实验结果的干扰。
常用的外泌体染料包括荧光染料（如dii、dio、pkh67等）和蛋白质标记染料（如cd63、cd81等抗体标记染料）。这些染料可以通过荧光显微镜、流式细胞术和电子显微镜等技术来观察和检测外泌体。pkh可提供长时间的活细胞荧光膜标记，且无明显毒性作用。膜染料pkh67是一种绿色荧光染料，其激发（490 nm）和发射（504 nm）波长与荧光素和fitc相近。pkh26是红色光谱中的荧光染料，其峰值激发（551 nm）和发射（567 nm）波长特性与罗丹明或藻红蛋白（pe）检测通道兼容，并且也可以被488 nm激光激发。目前pkh染料已成功用于体外和体内跟踪实验中标记外泌体和细胞外囊泡。例如，一项研究发现，人脂肪组织源间充质干细胞（adscs）释放的外泌体可以通过荧光染料pkh26进行标记，并且这些标记的外泌体可以释放功能性的neprilysin，从而对肿瘤具有治疗效果。
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20 µl
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