手把手教你学会 CRISPR Cas9 基因敲除技术
crispr/cas 是进行基因编辑的强大工具，可以对基因进行定点的编辑。在向导 rna(guide rna， grna)和 cas9 蛋白的参与下，待编辑的细胞基因组 dna 将被看作病毒或外源 dna，被剪切。
一、寻找目的基因的靶标
靶点挑选要点：
基因敲除靶点应设计在起始密码子附近(包括起始密码子)或者起始密码子下游的外显子范围内。
不同 cas9/grna 靶点在基因敲除效率上有较大差异，因此同时设计构建 2～3 个靶点的基因敲除载体再从中选出敲减效果较佳的靶点。
n1-n20 ngg 靠近 pam 的碱基对靶点的特异性很重要，前 7～12 个碱基的错配对 cas9 切割效率影响较小。设计好的靶点序列应在基因库中进行 blast 检测。
cas9nicknase 需要挑选成对的靶点。一般在正义链和反义链上分别挑选相距 20～30bp 的靶点配对。多对靶点的敲除效率常有较大差异。由于基因敲除实验时间长，在正式对目的细胞进行敲除前对靶点进行验证和挑选非常必要。
二、 插入片段设计
插入寡核苷酸序列设计(必须 page 纯化寡核苷酸)：
正向序列
5’acaccgnnnnnnnnnnnnnnnnnnngttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgtt3’
反向序列
3’tgtggcnnnnnnnnnnnnnnnnnnncaaaatctcgatctttatcgttcaattttattccgatcaggcaa5’
插入片段的合成
用水将寡核苷酸稀释为 100 μm。按以下体系配制退火反应体系：
正义寡核苷酸(100 μm)5μl
反义寡核苷酸(100 μm)5μl
nacl 100 mm(终浓度)
tris‐cl ph7.4 50 mm(终浓度)
加水补足 50 μl
将配制好的退火反应缓冲液重复混合，短暂离心后放置 pcr 仪上，运行以下程序： 90℃ 4 min， 70℃ 10 min， 55℃ 10 min， 40℃ 10 min， 25℃ 10 min。退火后的寡核苷酸可以立刻使用或者在 ‐20℃ *保存。
三、 pcas9/grna 基因敲除载体的构建
用 ecorv 酶切 2 μg pcas9/grna 载体(inovogen)。通常情况下用大约 20～30 单位的酶大约 3 小时可以酶切*。酶切后我们建议用琼脂糖凝胶回收线性化载体。将回收后的线性化载体定量，通常线性化载体的工作浓度为 50～100ng/μl。连接用水将退火后双链寡核苷酸 (10 μm) 稀释 100 倍备用。
连接反应体系：
t4 dna 连接酶 5u
ecorv 5u
线性化载体 2 μl
稀释 100 倍后双链寡核苷酸 1 μl
10× 连接酶 buffer 1 μl
50% peg4000 1 μl
加水补足 10 μl
反应条件： 22℃ 30 min， 37℃ 15 min。
注：
平末端连接效率较低，在连接体系中添加 peg4000 可以提高连接效率。
在连接体系中添加 ecorv 酶可以显着提**性率。
四、 转化大肠杆菌感受态细胞及通过载体上的引物进行 pcr 鉴定阳性克隆
挑选阳性克隆进行测序验证, 验证正确后, 提取质粒进行转染试验, 关于 sgrna 是否有效。可以转染之后，直接提取 dna，通过测序验证，如果在靶标位点附近开始出现杂乱的多峰说明是 sgrna 有效，如果没有则该 sgrna 无效。
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基因敲除靶点应设计在起始密码子附近(包括起始密码子)或者起始密码子下游的外显子范围内。
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二、 插入片段设计
插入寡核苷酸序列设计(必须 page 纯化寡核苷酸)：
正向序列
5’acaccgnnnnnnnnnnnnnnnnnnngttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgtt3’
反向序列
3’tgtggcnnnnnnnnnnnnnnnnnnncaaaatctcgatctttatcgttcaattttattccgatcaggcaa5’
插入片段的合成
用水将寡核苷酸稀释为 100 μm。按以下体系配制退火反应体系：
正义寡核苷酸(100 μm)5μl
反义寡核苷酸(100 μm)5μl
nacl 100 mm(终浓度)
tris‐cl ph7.4 50 mm(终浓度)
加水补足 50 μl
将配制好的退火反应缓冲液重复混合，短暂离心后放置 pcr 仪上，运行以下程序： 90℃ 4 min， 70℃ 10 min， 55℃ 10 min， 40℃ 10 min， 25℃ 10 min。退火后的寡核苷酸可以立刻使用或者在 ‐20℃ *保存。
三、 pcas9/grna 基因敲除载体的构建
用 ecorv 酶切 2 μg pcas9/grna 载体(inovogen)。通常情况下用大约 20～30 单位的酶大约 3 小时可以酶切*。酶切后我们建议用琼脂糖凝胶回收线性化载体。将回收后的线性化载体定量，通常线性化载体的工作浓度为 50～100ng/μl。连接用水将退火后双链寡核苷酸 (10 μm) 稀释 100 倍备用。
连接反应体系：
t4 dna 连接酶 5u
ecorv 5u
线性化载体 2 μl
稀释 100 倍后双链寡核苷酸 1 μl
10× 连接酶 buffer 1 μl
50% peg4000 1 μl
加水补足 10 μl
反应条件： 22℃ 30 min， 37℃ 15 min。
注：
平末端连接效率较低，在连接体系中添加 peg4000 可以提高连接效率。
在连接体系中添加 ecorv 酶可以显着提**性率。
四、 转化大肠杆菌感受态细胞及通过载体上的引物进行 pcr 鉴定阳性克隆
挑选阳性克隆进行测序验证, 验证正确后, 提取质粒进行转染试验, 关于 sgrna 是否有效。可以转染之后，直接提取 dna，通过测序验证，如果在靶标位点附近开始出现杂乱的多峰说明是 sgrna 有效，如果没有则该 sgrna 无效。
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