明胶酶谱试剂盒操作步骤详解
明胶酶谱试剂盒操作步骤详解
上海信帆生物供应明胶酶谱试剂盒，产品可以用于检测mmp2、mmp9的活性。
检测步骤：
1. 制备含 mmp 底物蛋白的 sds-page 凝胶：推荐分离胶浓度为 8%。按照标准程序制备 sds- page 凝胶。将 10 × substrate g 融化，并 90 ºc 加热 5 分钟。分别在浓缩胶和分离胶中额外加 入 10 × substrate g 并使之稀释 10 倍，混匀后加入过硫酸铵和 temed，等待凝胶聚合。
2. 待测样品 1:1 稀释于 2 × sds-page non-reducing buffer (用完后可自行配制：4% sds, 100 mm tris-cl ph6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混合后直接上样。切勿加热变性，并且仅 使用不加还原剂的上样缓冲液。可通过预试验确定加样量，使用普通蛋白预染 marker 即可。阳 性对照(可选步骤)：可取人、小鼠、大鼠或兔 100µl 全血与 100µl 2 × sds-page non-
reducing buffer 等体积混合，取 5-15µl 上样。
3. 低电流恒流电泳，每一块小胶电流为 20 ma/gel。溴酚蓝跑出凝胶前沿时结束电泳。
4. 洗涤凝胶：取出凝胶，去除浓缩胶，放入容器内。可先用适量蒸馏水冲洗凝胶，然后加入 10 ml
1× buffer a(用蒸馏水稀释)，室温漂洗凝胶 2 × 30 分钟。中间换液。
5. 孵育：倒掉 buffer a。加入 10 ml 1× buffer b(蒸馏水稀释)，室温或 37ºc 孵育 1~5 小时。阳性 对 照或者血中的 mmp 通常 37ºc 孵育 1 小时即可显示。如 mmp 活性低，应延长孵育时间为 10 小时或 过一夜。
6. 显色：倒掉 buffer b，加入 sds-page 凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液（操作步骤见 sds-page 凝 胶蛋白质考马斯亮蓝染色液说明书）。凝胶的大部分区域被深染，在有 mmp 条带的位置 不被染 色而形成透亮区域。透明区域的位置和范围指示 mmp-2、mmp-9 的大小位置(酶谱)及 活性。阳 性对照将在 66~72 (mmp-2)、92 (mmp-9)、130 (prommp-9)、225 (prommp-9) kda 位置出现透 明条带。
7. 条带扫描：将凝胶放在扫描仪上扫描。虽然 mmp 条带透明，但凝胶背景并非真正全黑。解决 办法：可用非透射光扫描，或用软件图像处理程序调整背景显示为灰度显示，并尽量设置为黑 色。mmp 条带则为白色，这种背景黑条带白的格式是英文论文中zui常见的格式。
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2. 待测样品 1:1 稀释于 2 × sds-page non-reducing buffer (用完后可自行配制：4% sds, 100 mm tris-cl ph6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混合后直接上样。切勿加热变性，并且仅 使用不加还原剂的上样缓冲液。可通过预试验确定加样量，使用普通蛋白预染 marker 即可。阳 性对照(可选步骤)：可取人、小鼠、大鼠或兔 100µl 全血与 100µl 2 × sds-page non-
reducing buffer 等体积混合，取 5-15µl 上样。
3. 低电流恒流电泳，每一块小胶电流为 20 ma/gel。溴酚蓝跑出凝胶前沿时结束电泳。
4. 洗涤凝胶：取出凝胶，去除浓缩胶，放入容器内。可先用适量蒸馏水冲洗凝胶，然后加入 10 ml
1× buffer a(用蒸馏水稀释)，室温漂洗凝胶 2 × 30 分钟。中间换液。
5. 孵育：倒掉 buffer a。加入 10 ml 1× buffer b(蒸馏水稀释)，室温或 37ºc 孵育 1~5 小时。阳性 对 照或者血中的 mmp 通常 37ºc 孵育 1 小时即可显示。如 mmp 活性低，应延长孵育时间为 10 小时或 过一夜。
6. 显色：倒掉 buffer b，加入 sds-page 凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液（操作步骤见 sds-page 凝 胶蛋白质考马斯亮蓝染色液说明书）。凝胶的大部分区域被深染，在有 mmp 条带的位置 不被染 色而形成透亮区域。透明区域的位置和范围指示 mmp-2、mmp-9 的大小位置(酶谱)及 活性。阳 性对照将在 66~72 (mmp-2)、92 (mmp-9)、130 (prommp-9)、225 (prommp-9) kda 位置出现透 明条带。
7. 条带扫描：将凝胶放在扫描仪上扫描。虽然 mmp 条带透明，但凝胶背景并非真正全黑。解决 办法：可用非透射光扫描，或用软件图像处理程序调整背景显示为灰度显示，并尽量设置为黑 色。mmp 条带则为白色，这种背景黑条带白的格式是英文论文中zui常见的格式。
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