PCR扩增产物的克隆
pcr扩增产物的克隆可以：（1）获得目的dna片段；（2）用于原核表达的研究；（3）广泛应用于分子生物学相关研究。
平端连接法实验方法原理
平头连接是将制备好的平头载体和补平或削平的pcr产物直接进行连接。载体可用ecor v或sma i切成平头；pcr产物纯化后，可以在22℃用dna聚合酶i作用30min（利用该酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性）。
如果要求不高，pcr产物也可不加处理。如果使用stratagene公司的pfu dna聚合酶或new england biolabs公司的vent dna聚合酶，这两种酶有5’→3’校对能力，扩增出来的pcr产物已经是平头，可以不作平端处理。平端连接的一个显而易见的缺陷是连接效率低下，即使使用很高单位的连接酶，或在反应体系中加入peg 8000，也只能很有限地提率。
通常情况下，pcr产物可直接与平端载体dna进行连接，但其连接效率效低。因为taq dna聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性，能在两6条 dna链的3'末端加上一个多余的碱基，使合成的pcr产物成为3'突出一个碱基的dna分子。
这种dna分子的连接效率很低。由于pcr产物的效率通过较高，在采用大量t4 dna连接酶并配以5-10u t4 rna连接酶时，可显著提高其连接效率。
对于较短pcr产物，用pus19的hincⅱ位点进行克隆，以x-gal和iptg筛选，常可得到足量重组子。另一种提高克隆效率的途径是先用klenow大片段或t4dna聚合酶消去3'末端突出碱基将pcr产物变成平端dna，然后再用平端连接法克隆pcr产物。
实验材料
模板dna
试剂、试剂盒
sauiklenow片段t4连接酶
仪器、耗材
移液器、移液器吸头、pcr小管、dna扩增仪、电泳槽、电泳仪、台式高速离心机
实验步骤
一、pcr反应
1. 依次混匀下列试剂
（1）h2o：35 μl
（2）10×pcr反应缓冲液：5 μl
（3）25 mmol/l mgcl2：4 μl
（4） 4种dntp：4 μl
（5）上游引物（引物1）：0.5 μl
（6）下游引物（引物2）：0.5 μl
（7）模板dna（约1 ng）：0.5 μl
（8）混匀后离心5秒。
2. 将混合物在94℃下加热5分钟后冰冷，迅速离心数秒， 使管壁上液滴沉至管底，加入taq dna聚合酶（0.5 μl约2.5 u），混匀后稍离心，加入一滴矿物油覆盖于反应混合物上。
3. 用94℃变性1分钟，45℃退火1分钟， 72℃延伸2分钟， 循环35轮，进行pcr。zui后一轮循环结束后， 于72℃下保温10分钟，使反应产物扩增充分。
二、电泳
取10 μl扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析，检查反应产物及长度。
三、pcr产物的纯化
扩增的pcr产物如利用t-vector进行克隆，可直接使用，如用平未端或粘性未端连接，往往需要将产物纯化。
1. 酚/氯fang法
（1）取反应产物加100 μl te。
（2）加等体积氯fang混匀后用微型离心机10000 rpm离心15秒，用移液器将上层水相吸至新的小管中。这样抽提一次， 可除去覆盖在表面的矿物油。
（3）再用酚:氯fang:异戊醇抽提二次，每次回收上层水相。
（4）在水相中加300 μl 95％乙醇，置-20℃下30 min沉淀。
（5）在小离心机上10000 rpm离心10 min，吸净上清液。加入1 ml 70％乙醇，稍离后，吸净上清液.重复洗涤沉淀2次。将沉淀溶于7 ml ddh2o 中，待用。
2. wizard pcr dna纯化系统
wizard pcr dna纯化系统可以快速、有效、可靠地提取pcr扩增液中的dna，提纯后的dna可用于测序、标记、克隆等。 该系统中含有的试剂和柱子可供50次pcr产物的纯化，试剂包括：50 ml wizard pcr dna纯化树脂、5 ml 直接提取缓冲液、50支 wizard微型柱。
（1）吸取pcr反应液水相放于1.5 ml eppendorf管中。
（2）加100 ml直接提取缓冲液，涡旋混匀。
（3）加1 ml pcr dna纯化树脂，1分钟内涡旋混合3次。
（4）取一次性注射器， 取出注塞，并使注射筒与wizard微型柱连接，用移液枪将上述混合液加入注射筒中，并用注塞轻推，使混合物进入微型柱。
（5）将注射器与微型柱分开，取出注塞， 再将注射筒与微型柱相连，加入2 ml 80%异丙醇，对微型柱进行清洗。
（6）取出微型柱置于eppendorf管中，12 000 g离心20秒，以除去微型柱中的洗液。
（7）将微型柱放在一个新eppendorf管中，加50 μl te或水，静止1分钟后，12 000 g离心20秒。
（8）丢弃微型柱，eppendorf管中的溶液即为纯化dna，存放于4℃或-20℃。
四、载体加dt尾
1. 将1 μg puc19用smaⅰ全酶切。
2. 在小管中按上述pcr反应，加入各种混合物，除将4 μl 4种dntp改为4 μl 25 mm dttp。
3. 加入1 μl(5u)的taq dna聚合酶在72℃下加热2 h。
4. 按前面三中所述，用酚:氯fang:异戊醇抽提二次。
5. 加入2倍体积 95％乙醇，在-20℃下沉淀1 h。
6、离心，用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于10ml ddh2o中。
五、pcr产物与载体粘末端连接
1. 在7 ml pcr产物中加1 ml带dt尾的puc质粒。
2. 加1 ml t4dna连接酶，1 ml 10×连接缓中液，混匀，16℃连接过夜。
3. 取5 ml连接产物转化感受态细胞并筛选重组子。
六、pcr产物3'突出端切平及平末端连接
1. 在50 ml的pcr产物中，直接加0.5 ml t4 dna聚合酶混匀。
2. 37℃反应10分钟后，70℃灭活10分钟。
3. 用酚:氯fang抽提2次。
4. 乙醇沉淀。沉淀用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于7 ml ddh2o中。
5. 质粒用smal 切开后，70℃ 15分钟灭活酶，取1 ml （约0.1 mg）加入上述pcr产物中。加t4 dna连接酶1 ml ，连接缓冲液1 ml 。
6. 取5 ml 连接产物转化感受态细胞并筛选重组子。
收起
注意事项
1. pcr反应液可直接用于连接，但zuihao对pcr产物纯化后进行连接，既能去掉dntp与atp竞争连接酶又能浓缩pcr产物。
2. pcr非常灵敏， 操作应尽可能在无菌操作台中进行。
3. 吸头、离心管应高压灭菌， 每次吸头用毕应更换， 不要互相污染试剂。
4. 加试剂前， 应短促离心10秒钟， 然后再打开管盖， 以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。
5. 应设含除模板dna所有其它成分的负对照。
6. 纯化树脂在使用前必须充分混匀。
7. pcr产物中矿物油应尽量吸去，否则会影响提取dna的 产量。
收起
其他
一、 pcr反应中的主要成份
1. 引物
pcr反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是pcr成败的关键。引物设计和选择目的dna序列区域时可遵循下列原则：
（1） 引物长度约为16-30 bp， 太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费，且难以合成。
（2）引物中g+c含量通常为40%-60%，可按下式粗略估计引物的解链温度 tm＝4(g+c)+2(a+t)。
（3）四种碱基应随机分布，在3'端不存在连续3个g或c，因这样易导致错误引发。
（4）引物3'端与目的序列阅读框架中密码子*或第二位核苷酸对应， 以减少由于密码子摆动产生的不配对。
（5）在引物内， 尤其在3'端应不存在二级结构。
（6）两引物之间尤其在3'端不能互补， 以防出现引物二聚体， 减少产量。两引物间zuihao不存在4个连续碱基的同源性或互补性。
（7）引物5'端对扩增特异性影响不大， 可在引物设计时加上限制酶位点、核糖 体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记*、荧光素、地gao辛等。通常应在5'端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。
（8）引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳定的二级结构， 以免产生非特异性扩增，影响产量。
（9）简并引物应选用简并程度低的密码子， 例如选用只有一种密码子的met， 3'端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。
（10）一般pcr反应中的引物终浓度为0.2-1.0 μmol/l。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体， 过低则降低产量。利用紫外分光光度计， 可计算引物浓度， 在1cm光程比色杯中，260nm下，引物浓度可按下式计算：
x mol/l＝ od260/ a(16000)+c(70000)+g(12000)+t(9600)
x： 引物摩尔浓度，a、c、g、t：引物中4种不同碱基个数。
2. 4种三磷酸脱氧核苷酸(dntp)
（1）dntp应用naoh 将ph调至7.0，并用分光光度计测定其准确浓度。
（2）dntp原液可配成5-10 mmol/l并分装，-20℃贮存。一般反应中每种dntp的终浓度为20-200 μmol/l。
（3）理论上4 种 dntp各20 μmol/l，足以在100 μl反应中合成2.6 μg的dna。当dntp终浓度大于50 mmol/l时可抑制taq dna聚合酶的活性。4种dntp的浓度应该相等，以减少合成中由于某种dntp的不足出现的错误掺入。
3. mg2+
（1）mg2+浓度对taq dna聚合酶影响很大，它可影响酶的活性和真实性，影响引物退火和解链温度， 影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。
（2）通常mg2+浓度范围为0.5-2 mmol/l.对于一种新的pcr反应，可以用0.1-5 mmol/l的递增浓度的mg2+进行预备实验，选出zui适的mg2+浓度。
（3）在pcr反应混合物中， 应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团， 例如磷酸基团或edta等可能影响mg2+离子浓度的物质，以保证zui适mg2+浓度。
4. 模板
（1）pcr反应必须以dna为模板进行扩增， 模板dna可以是单链分子，也可以是双链分子，可以是线状分子，也可以是环状分子(线状分子比环状分子的扩增效果稍好)。
（2）就模板dna而言，影响pcr的主要因素是模板的数量和纯度.一般反应中的模板数量为102 -105 个拷贝，对于单拷贝基因，这需要0.1μg的人基因组dna，10ng的酵母dna，1ng的大肠杆菌dna.扩增多拷贝序列时，用量更少。
（3）灵敏的pcr可从一个细胞，一根头发，一个孢子或一个精子提取的dna中分析目的序列。
（4）模板量过多则可能增加非特异性产物。dna中的杂质也会影响pcr的效率。
5. taq dna聚合酶
一般taq dna聚合酶活性半衰期为92.5℃ 130 min，95℃ 40 min， 97℃ 5 min。现在人们又发现许多新的耐热的dna聚合酶，这些酶的活性在高温下活性可维持更长时间。
taq dna聚合酶的酶活性单位定义为74℃下，30 min，掺入10 nmol/l dntp到核酸中所需的酶量。taq dna聚合酶的一个致命弱点是它的出错率，一般pcr中出错率为2×10-4 核苷酸/每轮循环，在利用pcr克隆和进行序列分析时尤应注意.在100 μl pcr反应中，1.5-2单位的taq dna聚合酶就足以进行30轮循环。
所用的酶量可根据dna、引物及其它因素的变化进行适当的增减.酶量过多会使产物非特异性增加，过少则使产量降低。
反应结束后，如果需要利用这些产物进行下一步实验，需要预先灭活taq dna聚合酶， 灭活taq dna聚合酶的方法有：
（1）pcr产物经酚:氯fang抽提，乙醇沉淀。
（2）加入10 mmol/l的edta螯合mg2+。
（3） 99-100℃加热10 min。目前已有直接纯化pcr产物的kit可用。
6. 反应缓冲液
（1）反应缓冲液一般含10-50 mmol/l tris·cl (20℃下ph8.3-8.8)， 50 mmol/l kcl和适当浓度的mg2+。tris·cl在20℃时ph为8.3-8.8，但在实际pcr反应中，ph为6.8-7.8. 50 mmol/l的kcl有利于引物的退火。
（2）反应液可加入5mmol/l的二硫苏糖醇(ddt)或100 μg/ml的牛血清白蛋白(bsa)，它们可稳定酶活性，另外加入t4噬菌体的基因32蛋白则对扩增较长的dna片段有利。
（3）各种taq dna聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。
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平头连接是将制备好的平头载体和补平或削平的pcr产物直接进行连接。载体可用ecor v或sma i切成平头；pcr产物纯化后，可以在22℃用dna聚合酶i作用30min（利用该酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性）。
如果要求不高，pcr产物也可不加处理。如果使用stratagene公司的pfu dna聚合酶或new england biolabs公司的vent dna聚合酶，这两种酶有5’→3’校对能力，扩增出来的pcr产物已经是平头，可以不作平端处理。平端连接的一个显而易见的缺陷是连接效率低下，即使使用很高单位的连接酶，或在反应体系中加入peg 8000，也只能很有限地提率。
通常情况下，pcr产物可直接与平端载体dna进行连接，但其连接效率效低。因为taq dna聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性，能在两6条 dna链的3'末端加上一个多余的碱基，使合成的pcr产物成为3'突出一个碱基的dna分子。
这种dna分子的连接效率很低。由于pcr产物的效率通过较高，在采用大量t4 dna连接酶并配以5-10u t4 rna连接酶时，可显著提高其连接效率。
对于较短pcr产物，用pus19的hincⅱ位点进行克隆，以x-gal和iptg筛选，常可得到足量重组子。另一种提高克隆效率的途径是先用klenow大片段或t4dna聚合酶消去3'末端突出碱基将pcr产物变成平端dna，然后再用平端连接法克隆pcr产物。
实验材料
模板dna
试剂、试剂盒
sauiklenow片段t4连接酶
仪器、耗材
移液器、移液器吸头、pcr小管、dna扩增仪、电泳槽、电泳仪、台式高速离心机
实验步骤
一、pcr反应
1. 依次混匀下列试剂
（1）h2o：35 μl
（2）10×pcr反应缓冲液：5 μl
（3）25 mmol/l mgcl2：4 μl
（4） 4种dntp：4 μl
（5）上游引物（引物1）：0.5 μl
（6）下游引物（引物2）：0.5 μl
（7）模板dna（约1 ng）：0.5 μl
（8）混匀后离心5秒。
2. 将混合物在94℃下加热5分钟后冰冷，迅速离心数秒， 使管壁上液滴沉至管底，加入taq dna聚合酶（0.5 μl约2.5 u），混匀后稍离心，加入一滴矿物油覆盖于反应混合物上。
3. 用94℃变性1分钟，45℃退火1分钟， 72℃延伸2分钟， 循环35轮，进行pcr。zui后一轮循环结束后， 于72℃下保温10分钟，使反应产物扩增充分。
二、电泳
取10 μl扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析，检查反应产物及长度。
三、pcr产物的纯化
扩增的pcr产物如利用t-vector进行克隆，可直接使用，如用平未端或粘性未端连接，往往需要将产物纯化。
1. 酚/氯fang法
（1）取反应产物加100 μl te。
（2）加等体积氯fang混匀后用微型离心机10000 rpm离心15秒，用移液器将上层水相吸至新的小管中。这样抽提一次， 可除去覆盖在表面的矿物油。
（3）再用酚:氯fang:异戊醇抽提二次，每次回收上层水相。
（4）在水相中加300 μl 95％乙醇，置-20℃下30 min沉淀。
（5）在小离心机上10000 rpm离心10 min，吸净上清液。加入1 ml 70％乙醇，稍离后，吸净上清液.重复洗涤沉淀2次。将沉淀溶于7 ml ddh2o 中，待用。
2. wizard pcr dna纯化系统
wizard pcr dna纯化系统可以快速、有效、可靠地提取pcr扩增液中的dna，提纯后的dna可用于测序、标记、克隆等。 该系统中含有的试剂和柱子可供50次pcr产物的纯化，试剂包括：50 ml wizard pcr dna纯化树脂、5 ml 直接提取缓冲液、50支 wizard微型柱。
（1）吸取pcr反应液水相放于1.5 ml eppendorf管中。
（2）加100 ml直接提取缓冲液，涡旋混匀。
（3）加1 ml pcr dna纯化树脂，1分钟内涡旋混合3次。
（4）取一次性注射器， 取出注塞，并使注射筒与wizard微型柱连接，用移液枪将上述混合液加入注射筒中，并用注塞轻推，使混合物进入微型柱。
（5）将注射器与微型柱分开，取出注塞， 再将注射筒与微型柱相连，加入2 ml 80%异丙醇，对微型柱进行清洗。
（6）取出微型柱置于eppendorf管中，12 000 g离心20秒，以除去微型柱中的洗液。
（7）将微型柱放在一个新eppendorf管中，加50 μl te或水，静止1分钟后，12 000 g离心20秒。
（8）丢弃微型柱，eppendorf管中的溶液即为纯化dna，存放于4℃或-20℃。
四、载体加dt尾
1. 将1 μg puc19用smaⅰ全酶切。
2. 在小管中按上述pcr反应，加入各种混合物，除将4 μl 4种dntp改为4 μl 25 mm dttp。
3. 加入1 μl(5u)的taq dna聚合酶在72℃下加热2 h。
4. 按前面三中所述，用酚:氯fang:异戊醇抽提二次。
5. 加入2倍体积 95％乙醇，在-20℃下沉淀1 h。
6、离心，用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于10ml ddh2o中。
五、pcr产物与载体粘末端连接
1. 在7 ml pcr产物中加1 ml带dt尾的puc质粒。
2. 加1 ml t4dna连接酶，1 ml 10×连接缓中液，混匀，16℃连接过夜。
3. 取5 ml连接产物转化感受态细胞并筛选重组子。
六、pcr产物3'突出端切平及平末端连接
1. 在50 ml的pcr产物中，直接加0.5 ml t4 dna聚合酶混匀。
2. 37℃反应10分钟后，70℃灭活10分钟。
3. 用酚:氯fang抽提2次。
4. 乙醇沉淀。沉淀用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于7 ml ddh2o中。
5. 质粒用smal 切开后，70℃ 15分钟灭活酶，取1 ml （约0.1 mg）加入上述pcr产物中。加t4 dna连接酶1 ml ，连接缓冲液1 ml 。
6. 取5 ml 连接产物转化感受态细胞并筛选重组子。
收起
注意事项
1. pcr反应液可直接用于连接，但zuihao对pcr产物纯化后进行连接，既能去掉dntp与atp竞争连接酶又能浓缩pcr产物。
2. pcr非常灵敏， 操作应尽可能在无菌操作台中进行。
3. 吸头、离心管应高压灭菌， 每次吸头用毕应更换， 不要互相污染试剂。
4. 加试剂前， 应短促离心10秒钟， 然后再打开管盖， 以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。
5. 应设含除模板dna所有其它成分的负对照。
6. 纯化树脂在使用前必须充分混匀。
7. pcr产物中矿物油应尽量吸去，否则会影响提取dna的 产量。
收起
其他
一、 pcr反应中的主要成份
1. 引物
pcr反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是pcr成败的关键。引物设计和选择目的dna序列区域时可遵循下列原则：
（1） 引物长度约为16-30 bp， 太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费，且难以合成。
（2）引物中g+c含量通常为40%-60%，可按下式粗略估计引物的解链温度 tm＝4(g+c)+2(a+t)。
（3）四种碱基应随机分布，在3'端不存在连续3个g或c，因这样易导致错误引发。
（4）引物3'端与目的序列阅读框架中密码子*或第二位核苷酸对应， 以减少由于密码子摆动产生的不配对。
（5）在引物内， 尤其在3'端应不存在二级结构。
（6）两引物之间尤其在3'端不能互补， 以防出现引物二聚体， 减少产量。两引物间zuihao不存在4个连续碱基的同源性或互补性。
（7）引物5'端对扩增特异性影响不大， 可在引物设计时加上限制酶位点、核糖 体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记*、荧光素、地gao辛等。通常应在5'端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。
（8）引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳定的二级结构， 以免产生非特异性扩增，影响产量。
（9）简并引物应选用简并程度低的密码子， 例如选用只有一种密码子的met， 3'端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。
（10）一般pcr反应中的引物终浓度为0.2-1.0 μmol/l。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体， 过低则降低产量。利用紫外分光光度计， 可计算引物浓度， 在1cm光程比色杯中，260nm下，引物浓度可按下式计算：
x mol/l＝ od260/ a(16000)+c(70000)+g(12000)+t(9600)
x： 引物摩尔浓度，a、c、g、t：引物中4种不同碱基个数。
2. 4种三磷酸脱氧核苷酸(dntp)
（1）dntp应用naoh 将ph调至7.0，并用分光光度计测定其准确浓度。
（2）dntp原液可配成5-10 mmol/l并分装，-20℃贮存。一般反应中每种dntp的终浓度为20-200 μmol/l。
（3）理论上4 种 dntp各20 μmol/l，足以在100 μl反应中合成2.6 μg的dna。当dntp终浓度大于50 mmol/l时可抑制taq dna聚合酶的活性。4种dntp的浓度应该相等，以减少合成中由于某种dntp的不足出现的错误掺入。
3. mg2+
（1）mg2+浓度对taq dna聚合酶影响很大，它可影响酶的活性和真实性，影响引物退火和解链温度， 影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。
（2）通常mg2+浓度范围为0.5-2 mmol/l.对于一种新的pcr反应，可以用0.1-5 mmol/l的递增浓度的mg2+进行预备实验，选出zui适的mg2+浓度。
（3）在pcr反应混合物中， 应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团， 例如磷酸基团或edta等可能影响mg2+离子浓度的物质，以保证zui适mg2+浓度。
4. 模板
（1）pcr反应必须以dna为模板进行扩增， 模板dna可以是单链分子，也可以是双链分子，可以是线状分子，也可以是环状分子(线状分子比环状分子的扩增效果稍好)。
（2）就模板dna而言，影响pcr的主要因素是模板的数量和纯度.一般反应中的模板数量为102 -105 个拷贝，对于单拷贝基因，这需要0.1μg的人基因组dna，10ng的酵母dna，1ng的大肠杆菌dna.扩增多拷贝序列时，用量更少。
（3）灵敏的pcr可从一个细胞，一根头发，一个孢子或一个精子提取的dna中分析目的序列。
（4）模板量过多则可能增加非特异性产物。dna中的杂质也会影响pcr的效率。
5. taq dna聚合酶
一般taq dna聚合酶活性半衰期为92.5℃ 130 min，95℃ 40 min， 97℃ 5 min。现在人们又发现许多新的耐热的dna聚合酶，这些酶的活性在高温下活性可维持更长时间。
taq dna聚合酶的酶活性单位定义为74℃下，30 min，掺入10 nmol/l dntp到核酸中所需的酶量。taq dna聚合酶的一个致命弱点是它的出错率，一般pcr中出错率为2×10-4 核苷酸/每轮循环，在利用pcr克隆和进行序列分析时尤应注意.在100 μl pcr反应中，1.5-2单位的taq dna聚合酶就足以进行30轮循环。
所用的酶量可根据dna、引物及其它因素的变化进行适当的增减.酶量过多会使产物非特异性增加，过少则使产量降低。
反应结束后，如果需要利用这些产物进行下一步实验，需要预先灭活taq dna聚合酶， 灭活taq dna聚合酶的方法有：
（1）pcr产物经酚:氯fang抽提，乙醇沉淀。
（2）加入10 mmol/l的edta螯合mg2+。
（3） 99-100℃加热10 min。目前已有直接纯化pcr产物的kit可用。
6. 反应缓冲液
（1）反应缓冲液一般含10-50 mmol/l tris·cl (20℃下ph8.3-8.8)， 50 mmol/l kcl和适当浓度的mg2+。tris·cl在20℃时ph为8.3-8.8，但在实际pcr反应中，ph为6.8-7.8. 50 mmol/l的kcl有利于引物的退火。
（2）反应液可加入5mmol/l的二硫苏糖醇(ddt)或100 μg/ml的牛血清白蛋白(bsa)，它们可稳定酶活性，另外加入t4噬菌体的基因32蛋白则对扩增较长的dna片段有利。
（3）各种taq dna聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。
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