测定三文鱼和牛肉中的 19 种多环芳烃
摘要：本应用简报介绍了用于分析三文鱼和牛肉中的多环芳烃 (pah) 残留物的多残留方法的开发与验证。该方法使用液相萃取以及 agilent captiva emr-lipid 净化，并通过 gc/ms/ms 进行分析。使用固/液萃取 (sole) 对三文鱼或牛肉样品进行萃取，再通过 captiva emr-lipid 净化。然后使用异辛烷对净化的样品洗脱液进行反萃取，以在安捷伦 gc/ms/ms 分析之前去除水。在两步法 sole 中使用乙酸乙酯和乙腈的混合物，改善了脂质食品基质中 pah 的萃取效率。agilent captiva emr-lipid 过滤柱能够实现对样品基质的高效选择性净化，并采用三文鱼和牛肉样品对开发的方法进行了验证。结果表明，所有检测的 pah 化合物均获得了满足欧盟委员会规定（回收率 50%–120%）的可接受的回收率结果，rsd 低于 20%，且三文鱼和牛肉样品中浓度为 1–500 ng/g 的分析物的校准曲线 r2 高于 0.99。通过重量法测得，三文鱼和牛肉样品中基质共萃取残留物的去除效率分别为 60% 和 92%。
前言： pah 是一类普遍存在的有毒化合物，其特征是具有热力学稳定的稠合芳香环结构。这些化合物天然存在于原油和煤中，也可以于食品的加工过程中形成。pah 化合物可根据稠合芳香环的数量进行分类，例如分为轻 pah（具有 2–3 个环）和重 pah（具有 4–6 个环）。重 pah 比轻 pah 更稳定且毒性更高。由于它们具有疑似或经证实的致突变性或致癌性，这些化合物已经得到广泛研究和监管。美国食品* (fda) 要求对海鲜中低 ppb 级的 pah 进行分析1 。欧盟委员会 (ec) 规定了四种重 pah 化合物（苯并 (a)芘、苯并(a)蒽、苯并(b)荧蒽和䓛）的分析方法标准，要求每种 pah 的定量限 (loq) 达到 0.9 µg/kg 且检测限 (lod) 达到 0.3 µg/kg2 。 pah 为强亲脂性化合物，容易在鱼、肉、油和牛奶等脂质食品中发生生物累积。脂质食品基质中 pah 的分析所面临的主要挑战，是将目标分析物与食品基质中存在的大量脂质化合物分离。这一挑战包括从脂肪基质中高效提取 pah，然后选择性去除不需要的脂肪基质共萃取物。常用的样品前处理技术包括索氏提取3 、超声辅助固/液萃取4 、加压溶剂萃取5 和 quechers 萃取6 。这些技术可以与固相萃取7 (spe) 或凝胶渗透色谱8 等净化步骤配合使用。
安捷伦增强型脂质去除 (emr-lipid) dspe 净化产品自 2015 年推出以来就备受关注。emr-lipid dspe 吸附剂与脂类的无支链烃链发生选择性相互作用，在溶液中留下大量目标分析物以供后续分析。这一选择性相互作用使其成为脂质食品基质中多类别多残留分析的理想选择。与传统的 bond elut quechers emr-lipid (50%) 相比，captiva emr-lipid 过滤柱只需更少的水进行吸附剂活化 (20%)。这一变化简化了工作流程，并改善了疏水性化合物在净化过程中的回收率9 。
本研究考察了使用 captiva emr-lipid 过滤柱流通式净化进行样品前处理，并通过 gc/ms/ms 分析三文鱼和牛肉中的 19 种 pah 化合物。开发此方法的目的在于，改善先前使用 bond elut quechers emr-lipid dspe 净化测定食品中 pah 的方法的局限性10。表 1 显示了所检测的农药的分类、log p 值、保留时间和 ms/ms 离子对。
实验部分：化学品与试剂 pah 和内标来自 ultra-scientific (north kingstown, ri, usa) 或安捷伦。hplc 级乙腈 (acn)、丙酮和乙酸乙酯 (etoac) 购自 honeywell (muskegon, mi, usa)。试剂级异辛烷购自 sigma-aldrich (st. louis, mo, usa)。
溶液与标准品用丙酮配制两种浓度分别为 2000 µg/ml 和 500 µg/ml 的 pah 储备液。用丙酮由储备液制得浓度为 4 µg/ml 的工作溶液。然后每天用丙酮新鲜配制浓度为 1 µg/ml 的加标溶液以用于样品加标。用丙酮配制包含五种浓度为 20 µg/ml 的内标化合物的内标工作溶液。两种工作溶液均置于棕色玻璃样品瓶中，在 4 °c 的冰箱中储存一个月。配制 20:80 etoac/acn 萃取溶剂和 16:64:20 acn/etoac/水洗脱溶液，室温储存。
仪器与材料将 agilent 7890b 气相色谱系统与 agilent 7000d 三重四极杆 gc/ms 联用开展研究。气相色谱系统配备电子气路控制 (epc)、支持风冷的多模式进样口 (mmi)、 agilent 7693a 自动液体进样器 (als) 以及基于辅助 epc 模块控制的吹扫 ultimate 接头的反吹系统。采用 agilent masshunter 工作站软件进行数据采集和分析。
结果与讨论： emr-lipid 吸附剂和产品 emr-lipid 吸附剂使用新型化学键合相，它结合了体积排阻与疏水相互作用，可提供较高的脂质去除选择性和效率。仅含有无支链烃链的类脂分子能够进入 emr-lipid 吸附剂孔中，并通过疏水相互作用得以保留。不含类脂结构的目标分析物无法进入吸附剂孔中，因此留在溶液中以供后续分析。因此，emr-lipid 吸附剂可以将脂质与其他目标分析物分开，提供较高的分析物回收率和脂质去除效率。样品前处理优化样品前处理方法优化包括三个阶段： 1. sole 2. captiva emr-lipid 净化 3. 用于除水的后处理萃取步骤对于实现脂肪基质中疏水性 pah 化合物的高回收率至关重要。样品萃取的挑战在于 pah 分析物的高疏水性和脂质食品基质的复杂性。鉴于 sole 先前在萃取油基质中疏水性农药方面的成功应用9 ，直接使用 sole 和 20:80 etoac/acn 萃取溶剂作为初步方案。针对分析物回收率对萃取时间和多次 sole 进行优化，结果如图 3a 所示。结果表明，萃取时间越长， pah 萃取回收率越高。另外，与一步法 sole 相比，两步法 sole 提高了萃取效率。因此，使用两步法 sole 作为萃取方法，该方法采用 5 ml 萃取溶剂，并在每一步振摇 10 分钟。
然后研究了 emr-lipid 过滤柱净化的分析物回收率。由于 pah 化合物具有非常强的亲脂性（重 pah 尤其如此），因此使用二次洗脱对于获得良好的洗脱回收率非常重要。结果（图 3b）表明，二次洗脱能够使洗脱回收率平均提高约 20%– 25%。此外，使用更强的溶剂（16:64:20 etoac/acn/水）可实现重 pah 的洗脱。对样品萃取和 emr-lipid 净化进行优化后，考察了用于除水的后处理步骤。用于在 gc/ms/ms 分析之前除水的 emr-lipid 后处理方法主要有三种： • 使用无水 mgso4 进行盐析 • 干燥和复溶 • 疏水性溶剂反萃取 (be) 表 3 分别列出了这三种后处理程序的一般方法、优缺点和适用性。由于 pah 是一类强疏水性化合物，因此非常适合采用疏水性溶剂反萃取法。该方法可实现溶剂转换和部分浓缩，并且对于轻 pah 和重 pah 化合物均适用。因此，在 captiva emr-lipid 净化后使用异辛烷溶剂 be 除水。图 3c 显示了异辛烷 be 步骤的回收率。使用这种优化的方法，在三种加标浓度下采集整个方法的分析物回收率：三文鱼和牛肉样品中加标浓度均为 1 ng/g、10 ng/g 和 100 ng/g (n = 6)。尽管不同基质间存在差异，但两种基质中不同加标浓度的所有 pah 分析物的回收率均处于可接受的限值范围 (50%–120%)。
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前言： pah 是一类普遍存在的有毒化合物，其特征是具有热力学稳定的稠合芳香环结构。这些化合物天然存在于原油和煤中，也可以于食品的加工过程中形成。pah 化合物可根据稠合芳香环的数量进行分类，例如分为轻 pah（具有 2–3 个环）和重 pah（具有 4–6 个环）。重 pah 比轻 pah 更稳定且毒性更高。由于它们具有疑似或经证实的致突变性或致癌性，这些化合物已经得到广泛研究和监管。美国食品* (fda) 要求对海鲜中低 ppb 级的 pah 进行分析1 。欧盟委员会 (ec) 规定了四种重 pah 化合物（苯并 (a)芘、苯并(a)蒽、苯并(b)荧蒽和䓛）的分析方法标准，要求每种 pah 的定量限 (loq) 达到 0.9 µg/kg 且检测限 (lod) 达到 0.3 µg/kg2 。 pah 为强亲脂性化合物，容易在鱼、肉、油和牛奶等脂质食品中发生生物累积。脂质食品基质中 pah 的分析所面临的主要挑战，是将目标分析物与食品基质中存在的大量脂质化合物分离。这一挑战包括从脂肪基质中高效提取 pah，然后选择性去除不需要的脂肪基质共萃取物。常用的样品前处理技术包括索氏提取3 、超声辅助固/液萃取4 、加压溶剂萃取5 和 quechers 萃取6 。这些技术可以与固相萃取7 (spe) 或凝胶渗透色谱8 等净化步骤配合使用。
安捷伦增强型脂质去除 (emr-lipid) dspe 净化产品自 2015 年推出以来就备受关注。emr-lipid dspe 吸附剂与脂类的无支链烃链发生选择性相互作用，在溶液中留下大量目标分析物以供后续分析。这一选择性相互作用使其成为脂质食品基质中多类别多残留分析的理想选择。与传统的 bond elut quechers emr-lipid (50%) 相比，captiva emr-lipid 过滤柱只需更少的水进行吸附剂活化 (20%)。这一变化简化了工作流程，并改善了疏水性化合物在净化过程中的回收率9 。
本研究考察了使用 captiva emr-lipid 过滤柱流通式净化进行样品前处理，并通过 gc/ms/ms 分析三文鱼和牛肉中的 19 种 pah 化合物。开发此方法的目的在于，改善先前使用 bond elut quechers emr-lipid dspe 净化测定食品中 pah 的方法的局限性10。表 1 显示了所检测的农药的分类、log p 值、保留时间和 ms/ms 离子对。
实验部分：化学品与试剂 pah 和内标来自 ultra-scientific (north kingstown, ri, usa) 或安捷伦。hplc 级乙腈 (acn)、丙酮和乙酸乙酯 (etoac) 购自 honeywell (muskegon, mi, usa)。试剂级异辛烷购自 sigma-aldrich (st. louis, mo, usa)。
溶液与标准品用丙酮配制两种浓度分别为 2000 µg/ml 和 500 µg/ml 的 pah 储备液。用丙酮由储备液制得浓度为 4 µg/ml 的工作溶液。然后每天用丙酮新鲜配制浓度为 1 µg/ml 的加标溶液以用于样品加标。用丙酮配制包含五种浓度为 20 µg/ml 的内标化合物的内标工作溶液。两种工作溶液均置于棕色玻璃样品瓶中，在 4 °c 的冰箱中储存一个月。配制 20:80 etoac/acn 萃取溶剂和 16:64:20 acn/etoac/水洗脱溶液，室温储存。
仪器与材料将 agilent 7890b 气相色谱系统与 agilent 7000d 三重四极杆 gc/ms 联用开展研究。气相色谱系统配备电子气路控制 (epc)、支持风冷的多模式进样口 (mmi)、 agilent 7693a 自动液体进样器 (als) 以及基于辅助 epc 模块控制的吹扫 ultimate 接头的反吹系统。采用 agilent masshunter 工作站软件进行数据采集和分析。
结果与讨论： emr-lipid 吸附剂和产品 emr-lipid 吸附剂使用新型化学键合相，它结合了体积排阻与疏水相互作用，可提供较高的脂质去除选择性和效率。仅含有无支链烃链的类脂分子能够进入 emr-lipid 吸附剂孔中，并通过疏水相互作用得以保留。不含类脂结构的目标分析物无法进入吸附剂孔中，因此留在溶液中以供后续分析。因此，emr-lipid 吸附剂可以将脂质与其他目标分析物分开，提供较高的分析物回收率和脂质去除效率。样品前处理优化样品前处理方法优化包括三个阶段： 1. sole 2. captiva emr-lipid 净化 3. 用于除水的后处理萃取步骤对于实现脂肪基质中疏水性 pah 化合物的高回收率至关重要。样品萃取的挑战在于 pah 分析物的高疏水性和脂质食品基质的复杂性。鉴于 sole 先前在萃取油基质中疏水性农药方面的成功应用9 ，直接使用 sole 和 20:80 etoac/acn 萃取溶剂作为初步方案。针对分析物回收率对萃取时间和多次 sole 进行优化，结果如图 3a 所示。结果表明，萃取时间越长， pah 萃取回收率越高。另外，与一步法 sole 相比，两步法 sole 提高了萃取效率。因此，使用两步法 sole 作为萃取方法，该方法采用 5 ml 萃取溶剂，并在每一步振摇 10 分钟。
然后研究了 emr-lipid 过滤柱净化的分析物回收率。由于 pah 化合物具有非常强的亲脂性（重 pah 尤其如此），因此使用二次洗脱对于获得良好的洗脱回收率非常重要。结果（图 3b）表明，二次洗脱能够使洗脱回收率平均提高约 20%– 25%。此外，使用更强的溶剂（16:64:20 etoac/acn/水）可实现重 pah 的洗脱。对样品萃取和 emr-lipid 净化进行优化后，考察了用于除水的后处理步骤。用于在 gc/ms/ms 分析之前除水的 emr-lipid 后处理方法主要有三种： • 使用无水 mgso4 进行盐析 • 干燥和复溶 • 疏水性溶剂反萃取 (be) 表 3 分别列出了这三种后处理程序的一般方法、优缺点和适用性。由于 pah 是一类强疏水性化合物，因此非常适合采用疏水性溶剂反萃取法。该方法可实现溶剂转换和部分浓缩，并且对于轻 pah 和重 pah 化合物均适用。因此，在 captiva emr-lipid 净化后使用异辛烷溶剂 be 除水。图 3c 显示了异辛烷 be 步骤的回收率。使用这种优化的方法，在三种加标浓度下采集整个方法的分析物回收率：三文鱼和牛肉样品中加标浓度均为 1 ng/g、10 ng/g 和 100 ng/g (n = 6)。尽管不同基质间存在差异，但两种基质中不同加标浓度的所有 pah 分析物的回收率均处于可接受的限值范围 (50%–120%)。
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