基因沉默介绍
在生物科学领域，基因沉默现象引起了科研人员极大的兴趣。基因沉默，顾名思义，是指通过特定手段使基因失去活性或降低其表达水平的过程。这一现象在生物体内普遍存在，对于维持生命活动的稳定以及应对各种环境变化具有重要意义。本文将详细介绍基因沉默的概念、常用技术和实验步骤，展望其应用前景，以期帮助读者更好地理解这一现象。
一、基因沉默的概念
基因沉默主要指基因表达的抑制和沉默现象。在生物体内，基因的表达受到严格调控，而基因沉默就是一种重要的基因表达调控方式。根据作用方式的不同，基因沉默可分为自然发生的基因沉默和人为操作的基因沉默。自然发生的基因沉默可通过多种因素实现，如dna甲基化、异染色质形成、转录后基因沉默（rnai）等。而人为操作的基因沉默则可以通过基因敲除、转录因子抑制、表观遗传修饰等方法实现。
二、常用基因沉默技术
rna干扰（rnai）：rnai技术利用双链rna（dsrna）引发特异性mrna的降解，从而降低或关闭目标基因的表达。rnai技术具有高效、特异性强、操作简单等优点，已成为研究基因功能和药物筛选的重要工具。然而，该技术也存在一定的脱靶效应和细胞毒性等问题。
化学沉默：化学沉默是指通过特定的化学抑制剂或药物作用于细胞，干扰基因的表达或转录过程，从而实现基因沉默。常用的化学沉默药物包括dna甲基化抑制剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂等。这类方法的优点是可以通过口服或注射给药，直接作用于患者体液或组织，但对于作用机制和药物剂量要求较高。
基因敲除：基因敲除技术通过同源重组或crispr-cas9等手段，将目标基因进行部分或wan全敲除。该技术具有较高的特异性和可操作性，但需要设计特异性的核酸酶，且存在一定的细胞毒性风险。
三、rna干扰（rnai）基因沉默技术的基本步骤
寻找目的基因：确定想要沉默的目标基因，可以通过文献研究、基因表达谱分析等方法来筛选。
设计并合成sirna：根据目标基因的序列，设计并合成能与目标基因特异结合的短发夹rna（short hairpin rna，shrna）。shrna在细胞内被转录和表达后，会形成约21-23bp的sirna。
转录和表达shrna：将设计好的shrna通过转染或者其他方式转入到细胞中，并在细胞内转录和表达shrna。
sirna与目标基因结合：转录后形成的sirna在细胞内与目标基因结合，抑制目标基因的表达。这一过程需要rna解旋酶将sirna双链解开，反义链与rna诱导沉默复合物risc形成复合物，最终由sirna互补结合靶rna引导核酸酶切割，实现转录后水平的基因沉默。
验证基因沉默效果：通过qrt-pcr、western blot等技术检测目标基因的表达水平，评估基因沉默效果。
这些步骤是rnai基因沉默技术的基本流程，具体操作可能因实验室和研究需求而有所不同。
ps：shrna和sirna在rnai过程中具有密切关系。它们都是具有一定结构特点的rna序列，在rnai通路中发挥关键作用。
sirna是rna干扰过程中触发基因沉默的主要分子。在rnai通路中，sirna通过与互补mrna分子杂交干扰基因表达。这种干扰会导致mrna降解，进而抑制特定基因的表达。
shrna是sirna的前体，由短发夹rna（short hairpin rna）加工而来。shrna的结构由互补的两条序列及loop环组成。在形成sirna的过程中，shrna会被dicer酶切割，生成21-23bp的sirna。然后，sirna会装载到risc复合物上，并与与其序列同源的靶mrna结合，引导risc复合物切割靶mrna，从而触发基因沉默。
总之，shrna和sirna在rnai过程中具有密切关系，shrna经过加工生成sirna，后者是触发基因沉默的关键分子。
四、基因沉默rnai试剂推荐
1. dharmacon可提供的sirna产品类型
1）on-targetplus™ sirna——全新的基因沉默标准，显著降低脱靶效应基因沉默中最主要的脱靶效应是由反义链中“seed region”活性引起的，一味地提高反义链的活性可能增加由反义链引起的脱靶。on-targetplus ™在smartselection技术基础上结合最新的功能性和特异性设计原则，并利用独—无二的双链修饰技术——结合正义链失活技术和反义链seed region 修饰技术，同时减少由双链引起的脱靶效应，使得on-targetplus™ sirna的脱靶效应降到zui低。
图注：on-targetplus™修饰减少了脱靶效应，而smartpool进一步减少了脱靶的数量
2）sigenome™ sirna——经济、可信的基因沉默工具sigenome™合理分析链偏好性，选择合适靶点，同时选择性使用on-target™技术保证沉默效率和低脱靶率。
3）accell™ sirna—无需任何转染试剂
极简的操作方法：无需转染试剂、电转仪器或病毒载体即可完成高效sirna投递
创新的sirna修饰zhuan利方法，同时拥有高摄取率、高稳定性、高特异性和高沉默效率
已在神经细胞、免疫细胞、原代细胞等难转染的细胞中成功应用
特殊的稳定性修饰，可直接应用于体内转染
低细胞毒性，可对细胞持续使用，延长靶基因的沉默持续时间
图注：accell™ sirna 操作步骤
2. dharmacon可提供的shrna产品类型
1）gipz™慢病毒载体shrna——模拟microrna设计的shrna，高效低毒，保证沉默效率
dharmacon针对人和小鼠的每个基因分别设计了多条shrna，从而保证沉默效率
turbogfp报告基因和shrna受同—启动子启动表达，监测shrna表达效果
可用于转导原代细胞或非分裂细
提供甘油菌克隆及克隆set，可利用puromycin筛选稳定细胞株
gipz shrna质粒载体元件示意图
上海优宁维生物科技股份有限公司
试剂 | 耗材 | 仪器 | 软件 | 定制 | 实验服务 | 供应链
微信公众平台：优宁维抗体专家，欢迎关注！
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sirna与目标基因结合：转录后形成的sirna在细胞内与目标基因结合，抑制目标基因的表达。这一过程需要rna解旋酶将sirna双链解开，反义链与rna诱导沉默复合物risc形成复合物，最终由sirna互补结合靶rna引导核酸酶切割，实现转录后水平的基因沉默。
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