PCR实验代测的模板浓度
pcr实验代测的模板浓度
服务内容：
1.制定个性化实验方案：根据不同的实验目的确定实验方案、选定合适的内参；
2.检测类别：mrna、mirna、lncrna、dna；
3.样本抽提及质检：对客户提供样本进行rna抽提，并利用nanodrop进行样本质检；
4.定量pcr预实验：包括样本反转录为cdna、配置pcr反应体系及进行real-timepcr反应；
5.正式定量pcr实验：根据预实验结果进行正式实验；
6.数据分析：采用2- △△ct法进行分析，比较不同样本间差异。
影响ct值的关键因素
模板浓度
模板浓度是决定ct的最主要因素。控制在一个合适范围内，使ct在15-35之间
反应液成分的影响
任何分子的荧光发射都受环境因素影响----比如溶液的ph值和盐浓度。
pcr反应的效率
pcr反应的效率也会影响ct值。在pcr扩增效率低的条件下进行连续梯度稀释扩增，与pcr扩增效率高的条件下相比，可能会所产生斜率不同的标准曲线。pcr效率取决于实验、反应混合液性能和样品质量。一般说来，反应效率在90-110%之间都是可以接受的。
real-time qpcr常见参数
基线（baseline）通常是3-15个循环的荧光信号
同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线
阈值（threshold）
自动设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍
手动设置：置于指数扩增期，刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强
同一次反应中针对不同的基因可单独设置阈值，但对于同一个基因扩增一定要用同一个阈值。
ct值:与起始浓度的对数成线性关系。
分析定量时候一般取ct:15-35。太大或者太小都会导致定量的不准确。
rn（normalized reporter）是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光发射强度的比值。
△rn：△rn是rn扣除基线后得到的标准化结果（△rn=rn-基线）。
如何评估实时定量pcr反应的效果
pcr扩增效率：为了正确地评估pcr扩增效率，至少需要做3次平行重复，至少做5个数量级倍数(5logs)连续梯度稀释模板浓度。
另一个评估pcr效率的关键参数是相关系数r2，它是说明两个数值之间相关程度的统计学术语。如果r2等于1，那么你可以用y值（ct）来准确预测x值（量）。如果r2等于0，你就不能通过y值来预测x值。r2值大于0.99 时，两个数值之间相关的可信度很好。
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4.定量pcr预实验：包括样本反转录为cdna、配置pcr反应体系及进行real-timepcr反应；
5.正式定量pcr实验：根据预实验结果进行正式实验；
6.数据分析：采用2- △△ct法进行分析，比较不同样本间差异。
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△rn：△rn是rn扣除基线后得到的标准化结果（△rn=rn-基线）。
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另一个评估pcr效率的关键参数是相关系数r2，它是说明两个数值之间相关程度的统计学术语。如果r2等于1，那么你可以用y值（ct）来准确预测x值（量）。如果r2等于0，你就不能通过y值来预测x值。r2值大于0.99 时，两个数值之间相关的可信度很好。
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