PCR-荧光探针法 |羊源、鸭源、猪源、牛源性成分多重核酸检测试剂盒
该试剂盒采用探针法四重实时荧光定量pcr技术，针对羊源、鸭源、猪源、牛源性成分核酸序列设计特异性引物和荧光探针，通过实时荧光定量pcr(taqman探针法) 扩增曲线判断肉及肉制品中羊源、鸭源、猪源、牛源性成分核酸进行定性及定量检测。
适用仪器：abi系列 (abi 7300/abi 7500/step one等)，罗氏lightcycler系列，伯乐cfx 96 ，北京鲲鹏基因x系列，三狮生物q162d等实时荧光定量pcr仪。
实验操作：1. 样本制备 (样本制备区)
参照总dna/rna提取试剂盒说明书，或使用es08全自动核酸提取仪配套快速核酸提取试剂盒 (磁珠法)，或其他符合相关标准的核酸提取试剂盒/方法，对样本进行核酸提取。提取的核酸尽量及时进行检测，否则于-20℃保存。
2.配制反应体系 (加样区)
2.1 取出多重反应液管，阳性对照管，阴性对照管，室温条件下使试剂解冻，离心10秒，将管壁和管盖内的液体离心至管底，放在冰盒中备用。
2.2 取实验所需的pcr反应管 (n+2 ，即n个待检样本+阳性对照+阴性对照) ，反应液充分吹吸混匀后，分别吸取 24μl反应液至每个pcr反应管内，然后依次添加 1μl阴性对照、样本核酸和阳性对照，盖好管盖，作好记录，每个反应总体积为 25μl 。充分混匀，离心 30 秒后在 实时荧光定量pcr仪上进行扩增实验。
3.荧光pcr扩增 (扩增及产物分析区)
95℃预变性 5 分钟；95℃变性 10 秒，58℃退火延伸 30 秒，40 个循环，在 58℃时收集荧 光信号。荧光基团选择fam/vic/rox/cy5 ，淬灭基团选择none。
4.结果判定
4.1阳性对照fam/vic/rox/cy5 通道的ct值均＜30 且出现“s”型扩增曲线，阴性对照 无ct值或ct值≥40 且无“s”型扩增曲线，实验结果有效；否则应重新进行实验。
4.2待检样本fam/vic/rox/cy5 通道的ct值≤36 且出现“s”型扩增曲线，判定为阳性。 fam通道阳性表明样本中含有羊源性成分，vic通道阳性表明样本中含有鸭源性成分，rox通道阳性表明样本中含有猪源性成分，cy5 通道阳性表明样本中含有牛源性成分。
4.3样本检测结果 36＜ct＜40 ，判定为可疑。应对样本进行复测，如复测ct值＜40 ，且有 明显的扩增曲线，则判定为阳性，否则判定为阴性。
4.4 样本检测结果无ct值或ct值≥40 且无“s”型扩增曲线，判定为阴性。
关键词：全自动核酸提取仪
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实验操作：1. 样本制备 (样本制备区)
参照总dna/rna提取试剂盒说明书，或使用es08全自动核酸提取仪配套快速核酸提取试剂盒 (磁珠法)，或其他符合相关标准的核酸提取试剂盒/方法，对样本进行核酸提取。提取的核酸尽量及时进行检测，否则于-20℃保存。
2.配制反应体系 (加样区)
2.1 取出多重反应液管，阳性对照管，阴性对照管，室温条件下使试剂解冻，离心10秒，将管壁和管盖内的液体离心至管底，放在冰盒中备用。
2.2 取实验所需的pcr反应管 (n+2 ，即n个待检样本+阳性对照+阴性对照) ，反应液充分吹吸混匀后，分别吸取 24μl反应液至每个pcr反应管内，然后依次添加 1μl阴性对照、样本核酸和阳性对照，盖好管盖，作好记录，每个反应总体积为 25μl 。充分混匀，离心 30 秒后在 实时荧光定量pcr仪上进行扩增实验。
3.荧光pcr扩增 (扩增及产物分析区)
95℃预变性 5 分钟；95℃变性 10 秒，58℃退火延伸 30 秒，40 个循环，在 58℃时收集荧 光信号。荧光基团选择fam/vic/rox/cy5 ，淬灭基团选择none。
4.结果判定
4.1阳性对照fam/vic/rox/cy5 通道的ct值均＜30 且出现“s”型扩增曲线，阴性对照 无ct值或ct值≥40 且无“s”型扩增曲线，实验结果有效；否则应重新进行实验。
4.2待检样本fam/vic/rox/cy5 通道的ct值≤36 且出现“s”型扩增曲线，判定为阳性。 fam通道阳性表明样本中含有羊源性成分，vic通道阳性表明样本中含有鸭源性成分，rox通道阳性表明样本中含有猪源性成分，cy5 通道阳性表明样本中含有牛源性成分。
4.3样本检测结果 36＜ct＜40 ，判定为可疑。应对样本进行复测，如复测ct值＜40 ，且有 明显的扩增曲线，则判定为阳性，否则判定为阴性。
4.4 样本检测结果无ct值或ct值≥40 且无“s”型扩增曲线，判定为阴性。
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