有关RT-PCR详细阐述
rt-pcr是指将逆转录(reverse transcription；rt)反应和pcr (polymerase chain reaction)反应组合在一起的方法。
1、 rt-pcr的原理
rt-pcr将以rna为模板的cdna合成同pcr结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。rt-pcr用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cdna文库克隆cdna。rt-pcr比其他包括northern印迹、rnase保护分析、原位杂交及s1核酸酶分析在内的rna分析技术，更灵敏，更易于操作。
rt-pcr的模板可以为总rna或poly(a)+选择性rna。逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo(dt)或基因特异性的引物（gsp）起始。rt-pcr可以一步法或两步法的形式进行。在两步法rt-pcr中，每一步都在最佳条件下进行。cdna的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行pcr。在一步法rt-pcr中，逆转录和pcr在同时为逆转录和pcr优化的条件下，在一只管中顺次进行。
2、 rt-pcr的步骤
⑴在冰浴离心管里面加入模板rna 4ul，引物2ul，去离子水5ul，混匀，离心3-5秒；
⑵70度水浴5分钟，冰浴30秒（此处是为了使引物和模板正确配对）；
⑶加入5×反应液4ul，rnase抑制剂1ul，dntp 2ul（这些应该先配好，然后分再装到每一管），混匀；
⑷37度水浴5分钟，加入1ul amv-rt反转录酶，混匀；
⑸37度水浴1小时（此步是反转录过程）；
⑹70度10分钟结束反应（此处是灭活酶活性，避免对后续实验产生干扰），产物置冰上进行下一步pcr实验，余下的-70度保存。
3、 rt-pcr的引物设计
rt-pcr引物设计和一般pcr引物设计可以遵循同样的原则。细心地进行引物设计是pcr中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。设计理想的引物都有以下共同的特点，而设计失败的引物则各有各的缺点：
* 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独te性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。
* 选择gc含量为40％到60％或gc含量反映模板gc含量的引物。
* 设计5'端和中间区为g或c的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。
* 避免引物对3'末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。
* 避免3'末端富含gc。设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个a或t。
* 避免3'末端的错误配对。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。
* 避免存在可能会产生内部二级结构的序列，这会破坏引物退火稳定性。
目的序列上并不存在的附加序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5'端而不影响特异性。当计算引物tm值时并不包括这些序列，但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。
引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在-20℃。以大于10μm浓度溶于te的引物在-20℃可以稳定保存6个月，但在室温（15℃到30℃）仅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室温（15℃到30℃）最多可以保存2个月。
4、引物退火温度
引物的另一个重要参数是熔解温度（tm）。这是当50％的引物和互补序列表现为双链dna分子时的温度。tm对于设定pcr退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的tm低5℃。
根据所使用的公式及引物序列的不同，tm会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的tm值，所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的tm 5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。为获得最佳结果，两个引物应具有近似的tm值。引物对的tm差异如果超过5℃，就会由于在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物tm不同，将退火温度设定为比tm低5℃。或者为了提高特异性，可以在根据较高tm设计的退火温度先进行5个循环，然后再根据较低tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严谨的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
5、提高逆转录保温温度
较高的保温温度有助于rna二级结构的打开，增加了反应的产量。对于多数rna模板，在没有缓冲液或盐的条件下，将rna和引物在65℃保温，然后迅速置于冰上冷却，可以消除大多数二级结构，从而使引物可以结合。然而某些模板仍然会存在二级结构，即使热变性后也是如此。较高的保温温度也可以增加特异性，尤其是当使用基因特异性引物（gsp）进行cdna合成时。如果使用gsp，确保引物的tm值与预计的保温温度相同。不要在高于60℃时使用oligo(dt)和随机引物。随机引物需要在增加到60℃前在25℃保温10分钟。除了使用较高的逆转录温度外，还可以通过直接将rna/引物混合物从65℃变性温度转到逆转录保温温度，并加入预热的2×的反应混合物提高特异性（cdna热启动合成）。这种方法有助于防止较低温度时所发生的分子间碱基配对。使用pcr仪可以简化rt-pcr所需的多种温度切换。
6、 促进逆转录的添加剂
包括甘油和dmso在内的添加剂加到第一链合成反应中，可以减低核酸双链的稳定并解开rna二级结构，最多可以加入20％的甘油或10％的dmso而不影响或mmlv的活性。amv也可以耐受最多20％的甘油而不降低活性。为了在逆转录反应中最大限度提高rt-pcr的灵敏度，可以加入10％的甘油并在45℃保温。如果1/10的逆转录反应产物加入到pcr中，那甘油在扩增反应中的浓度为0.4％，这不足以抑制pcr。
在逆转录反应中经常加入rnase抑制剂以增加cdna合成的长度和产量。rnase抑制剂要在第一链合成反应中，在缓冲液和还原剂（如dtt）存在的条件下加入，因为cdna合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可以降解rna的rnase。蛋白rnase抑制剂仅防止rnase a，b，c对rna的降解，并不能防止皮肤上的rnase，因此尽管使用了这些抑制剂，也要小心不要从手指上引入rnase。
使用无rnaseh活性（rnaseh-）的逆转录酶：逆转录酶催化rna转化成cdna，不管是m-mlv还是amv，在本身的聚合酶活性之外，都具有内源rnaseh活性。rnaseh活性同聚合酶活性相互竞争rna模板与dna引物或cdna延伸链间形成的杂合链，并降解rna：dna复合物中的rna链。被rnaseh活性所降解的rna模板不能再作为合成cdna的有效底物，降低了cdna合成的产量和长度。因此消除或大大降低逆转录酶的rnaseh活性将会大有裨益。rnaseh-的mmlv逆转录酶及rnaseh-的amv，比mmlv和amv能得到更多量和更多全长。rt-pcr灵敏度会受cdna合成量的影响。rt-pcr产物的大小受限于逆转录酶合成cdna的能力，尤其是克隆较大的cdna时。rnaseh-的逆转录酶可以显著提高长rt-pcr产物的产量，同时增加了热稳定性，所以反应可以在高于正常的37-42℃的温度下进行。
7、rnaseh处理
在pcr之前使用rnaseh处理cdna合成反应可以提高灵敏度。对于某些模板，据认为cdna合成反应中的rna会阻止扩增产物的结合，在这种情况下，rnaseh处理可以增加灵敏度。一般当扩增较长的全长cdna目标模板时，rnaseh处理是必需的，比如低拷贝的。对这种困难模板，rnaseh的处理加强了或amv合成的cdna所产生的信号。对于多数rt-pcr反应，rnaseh处理是可选的，因为95℃保温的pcr变性步骤一般会将rna：dna复合物中的rna水解掉。
8、 小量rna检测方法的提高
当仅有小量rna时，rt-pcr尤其具有挑战性。在rna分离过程中加入的作为载体的糖元有助于增加小量样品的产量。可以在加入trizol的同时加入无rnase的糖元。糖元是水溶性的，可以同rna保持在水相中以辅助随后的沉淀。对于小于50mg的组织或106个培养细胞的样品，无rnase糖元的建议浓度为250μg/ml。
9、 一步法同两步法rt-pcr的比较
两步法rt-pcr比较常见，在使用一个样品检测多个mrna时比较有用。然而一步法rt-pcr具有其他优点。一步法rt-pcr在处理大量样品时易于操作，有助于减少残余污染，因为在cdna合成和扩增之间不需要打开管盖。一步法可以得到更高的灵敏度，可以达到0.1pg总rna，这是因为整个cdna样品都被扩增。对于成功的一步法rt-pcr，一般使用反义的基因特异性引物起始cdna合成。
10、 增加rt-pcr特异性
第一链cdna合成的起始可以使用三种不同的方法，各种方法的相对特异性影响了所合成cdna的量和种类。
随机引物法是三种方法中特异性的。引物在整个转录本的多个位点退火，产生短的，部分长度的cdna。这种方法经常用于**5'末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的rna模板获得cdna。为了获得最长的cdna，需要按经验确定每个rna样品中引物与rna的比例。随机引物的起始浓度范围为50到250ng每20μl反应体系。因为使用随机引物从总rna合成的cdna主要是核糖体rna，所以模板一般选用poly(a)+rna。
oligo(dt)起始比随机引物特异性高。它同大多数真核细胞mrna 3'端所发现的poly(a)尾杂交。因为poly(a)+rna大概占总rna的1%到2％，所以与使用随机引物相比，cdna的数量和复杂度要少得多。因为其较高的特异性，oligo(dt)一般不需要对rna和引物的比例及poly(a)+选择进行优化。建议每20μl反应体系使用0.5μg oligo(dt)。oligo(dt)12-18适用于多数rt-pcr。thermoscript rt-pcr system提供了oligo(dt)20，因为其热稳定性较好，适用于较高的保温温度。
基因特异性引物（gsp）对于逆转录步骤是特异性引物。gsp是反义寡聚核苷，可以特异性地同rna目的序列杂交，而不象随机引物或oligo(dt)那样同所有rna退火。用于设计pcr引物的规则同样适用于逆转录反应gsp的设计。gsp可以同与mrna3'最末端退火的扩增引物序列相同，或gsp可以设计为与反向扩增引物的下游退火。对于部分扩增对象，为了成功进行rt-pcr，需要设计多于一个反义引物，因为目的rna的二级结构可能会阻止引物结合。建议在20μl的第一链合成反应体系中使用1pmol反义gsp。
11、 提高逆转录保温温度
为了充分利用gsp特异性的全部优点，应该使用有较高热稳定性的逆转录酶。热稳定逆转录酶可以在较高温度保温以增加反应严谨性。比如，如果一个gsp退火温度为55℃，那么如果使用amv或m-mlv在低严谨性的37℃进行逆转录，gsp所带有的特异性就没有利用。然而某些特别的逆转录酶可以在50℃或更高进行反应，这就会消除较低温度时产生的非特异性产物。为获得最大的特异性，可以将rna/引物混合物直接从65℃变性温度转移到逆转录保温温度。这有助于防止低温时分子间碱基配对。使用pcr仪可以简化rt-pcr所需的多种温度转换。
12、 减少基因组dna污染
rt-pcr所遇到的一个潜在的困难是rna中沾染的基因组dna。使用较好的rna分离方法，如trizol，会减少rna制备物中沾染的基因组dna。为了避免产生于基因组dna的产物，可以在逆转录之前使用扩增级的dnaseⅰ对rna进行处理以除去沾染的dna。将样品在2.0mm edta中65℃保温10分钟以终止dnaseⅰ消化。edta可以螯合镁离子，防止高温时所发生的依赖于镁离子的rna水解。
为了将扩增的cdna同沾染的基因组dna扩增产物分开，可以设计分别同分开的外显子退火的引物。来源于cdna的pcr产物会比来源于沾染的基因组dna的产物短。另外对每个rna模板进行一个无逆转录的对照实验，以确定一个给定片段是来自基因组dna还是cdna。在无逆转录时所得到的pcr产物来源于基因组。
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1、 rt-pcr的原理
rt-pcr将以rna为模板的cdna合成同pcr结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。rt-pcr用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cdna文库克隆cdna。rt-pcr比其他包括northern印迹、rnase保护分析、原位杂交及s1核酸酶分析在内的rna分析技术，更灵敏，更易于操作。
rt-pcr的模板可以为总rna或poly(a)+选择性rna。逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo(dt)或基因特异性的引物（gsp）起始。rt-pcr可以一步法或两步法的形式进行。在两步法rt-pcr中，每一步都在最佳条件下进行。cdna的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行pcr。在一步法rt-pcr中，逆转录和pcr在同时为逆转录和pcr优化的条件下，在一只管中顺次进行。
2、 rt-pcr的步骤
⑴在冰浴离心管里面加入模板rna 4ul，引物2ul，去离子水5ul，混匀，离心3-5秒；
⑵70度水浴5分钟，冰浴30秒（此处是为了使引物和模板正确配对）；
⑶加入5×反应液4ul，rnase抑制剂1ul，dntp 2ul（这些应该先配好，然后分再装到每一管），混匀；
⑷37度水浴5分钟，加入1ul amv-rt反转录酶，混匀；
⑸37度水浴1小时（此步是反转录过程）；
⑹70度10分钟结束反应（此处是灭活酶活性，避免对后续实验产生干扰），产物置冰上进行下一步pcr实验，余下的-70度保存。
3、 rt-pcr的引物设计
rt-pcr引物设计和一般pcr引物设计可以遵循同样的原则。细心地进行引物设计是pcr中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。设计理想的引物都有以下共同的特点，而设计失败的引物则各有各的缺点：
* 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独te性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。
* 选择gc含量为40％到60％或gc含量反映模板gc含量的引物。
* 设计5'端和中间区为g或c的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。
* 避免引物对3'末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。
* 避免3'末端富含gc。设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个a或t。
* 避免3'末端的错误配对。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。
* 避免存在可能会产生内部二级结构的序列，这会破坏引物退火稳定性。
目的序列上并不存在的附加序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5'端而不影响特异性。当计算引物tm值时并不包括这些序列，但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。
引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在-20℃。以大于10μm浓度溶于te的引物在-20℃可以稳定保存6个月，但在室温（15℃到30℃）仅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室温（15℃到30℃）最多可以保存2个月。
4、引物退火温度
引物的另一个重要参数是熔解温度（tm）。这是当50％的引物和互补序列表现为双链dna分子时的温度。tm对于设定pcr退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的tm低5℃。
根据所使用的公式及引物序列的不同，tm会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的tm值，所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的tm 5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。为获得最佳结果，两个引物应具有近似的tm值。引物对的tm差异如果超过5℃，就会由于在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物tm不同，将退火温度设定为比tm低5℃。或者为了提高特异性，可以在根据较高tm设计的退火温度先进行5个循环，然后再根据较低tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严谨的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
5、提高逆转录保温温度
较高的保温温度有助于rna二级结构的打开，增加了反应的产量。对于多数rna模板，在没有缓冲液或盐的条件下，将rna和引物在65℃保温，然后迅速置于冰上冷却，可以消除大多数二级结构，从而使引物可以结合。然而某些模板仍然会存在二级结构，即使热变性后也是如此。较高的保温温度也可以增加特异性，尤其是当使用基因特异性引物（gsp）进行cdna合成时。如果使用gsp，确保引物的tm值与预计的保温温度相同。不要在高于60℃时使用oligo(dt)和随机引物。随机引物需要在增加到60℃前在25℃保温10分钟。除了使用较高的逆转录温度外，还可以通过直接将rna/引物混合物从65℃变性温度转到逆转录保温温度，并加入预热的2×的反应混合物提高特异性（cdna热启动合成）。这种方法有助于防止较低温度时所发生的分子间碱基配对。使用pcr仪可以简化rt-pcr所需的多种温度切换。
6、 促进逆转录的添加剂
包括甘油和dmso在内的添加剂加到第一链合成反应中，可以减低核酸双链的稳定并解开rna二级结构，最多可以加入20％的甘油或10％的dmso而不影响或mmlv的活性。amv也可以耐受最多20％的甘油而不降低活性。为了在逆转录反应中最大限度提高rt-pcr的灵敏度，可以加入10％的甘油并在45℃保温。如果1/10的逆转录反应产物加入到pcr中，那甘油在扩增反应中的浓度为0.4％，这不足以抑制pcr。
在逆转录反应中经常加入rnase抑制剂以增加cdna合成的长度和产量。rnase抑制剂要在第一链合成反应中，在缓冲液和还原剂（如dtt）存在的条件下加入，因为cdna合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可以降解rna的rnase。蛋白rnase抑制剂仅防止rnase a，b，c对rna的降解，并不能防止皮肤上的rnase，因此尽管使用了这些抑制剂，也要小心不要从手指上引入rnase。
使用无rnaseh活性（rnaseh-）的逆转录酶：逆转录酶催化rna转化成cdna，不管是m-mlv还是amv，在本身的聚合酶活性之外，都具有内源rnaseh活性。rnaseh活性同聚合酶活性相互竞争rna模板与dna引物或cdna延伸链间形成的杂合链，并降解rna：dna复合物中的rna链。被rnaseh活性所降解的rna模板不能再作为合成cdna的有效底物，降低了cdna合成的产量和长度。因此消除或大大降低逆转录酶的rnaseh活性将会大有裨益。rnaseh-的mmlv逆转录酶及rnaseh-的amv，比mmlv和amv能得到更多量和更多全长。rt-pcr灵敏度会受cdna合成量的影响。rt-pcr产物的大小受限于逆转录酶合成cdna的能力，尤其是克隆较大的cdna时。rnaseh-的逆转录酶可以显著提高长rt-pcr产物的产量，同时增加了热稳定性，所以反应可以在高于正常的37-42℃的温度下进行。
7、rnaseh处理
在pcr之前使用rnaseh处理cdna合成反应可以提高灵敏度。对于某些模板，据认为cdna合成反应中的rna会阻止扩增产物的结合，在这种情况下，rnaseh处理可以增加灵敏度。一般当扩增较长的全长cdna目标模板时，rnaseh处理是必需的，比如低拷贝的。对这种困难模板，rnaseh的处理加强了或amv合成的cdna所产生的信号。对于多数rt-pcr反应，rnaseh处理是可选的，因为95℃保温的pcr变性步骤一般会将rna：dna复合物中的rna水解掉。
8、 小量rna检测方法的提高
当仅有小量rna时，rt-pcr尤其具有挑战性。在rna分离过程中加入的作为载体的糖元有助于增加小量样品的产量。可以在加入trizol的同时加入无rnase的糖元。糖元是水溶性的，可以同rna保持在水相中以辅助随后的沉淀。对于小于50mg的组织或106个培养细胞的样品，无rnase糖元的建议浓度为250μg/ml。
9、 一步法同两步法rt-pcr的比较
两步法rt-pcr比较常见，在使用一个样品检测多个mrna时比较有用。然而一步法rt-pcr具有其他优点。一步法rt-pcr在处理大量样品时易于操作，有助于减少残余污染，因为在cdna合成和扩增之间不需要打开管盖。一步法可以得到更高的灵敏度，可以达到0.1pg总rna，这是因为整个cdna样品都被扩增。对于成功的一步法rt-pcr，一般使用反义的基因特异性引物起始cdna合成。
10、 增加rt-pcr特异性
第一链cdna合成的起始可以使用三种不同的方法，各种方法的相对特异性影响了所合成cdna的量和种类。
随机引物法是三种方法中特异性的。引物在整个转录本的多个位点退火，产生短的，部分长度的cdna。这种方法经常用于**5'末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的rna模板获得cdna。为了获得最长的cdna，需要按经验确定每个rna样品中引物与rna的比例。随机引物的起始浓度范围为50到250ng每20μl反应体系。因为使用随机引物从总rna合成的cdna主要是核糖体rna，所以模板一般选用poly(a)+rna。
oligo(dt)起始比随机引物特异性高。它同大多数真核细胞mrna 3'端所发现的poly(a)尾杂交。因为poly(a)+rna大概占总rna的1%到2％，所以与使用随机引物相比，cdna的数量和复杂度要少得多。因为其较高的特异性，oligo(dt)一般不需要对rna和引物的比例及poly(a)+选择进行优化。建议每20μl反应体系使用0.5μg oligo(dt)。oligo(dt)12-18适用于多数rt-pcr。thermoscript rt-pcr system提供了oligo(dt)20，因为其热稳定性较好，适用于较高的保温温度。
基因特异性引物（gsp）对于逆转录步骤是特异性引物。gsp是反义寡聚核苷，可以特异性地同rna目的序列杂交，而不象随机引物或oligo(dt)那样同所有rna退火。用于设计pcr引物的规则同样适用于逆转录反应gsp的设计。gsp可以同与mrna3'最末端退火的扩增引物序列相同，或gsp可以设计为与反向扩增引物的下游退火。对于部分扩增对象，为了成功进行rt-pcr，需要设计多于一个反义引物，因为目的rna的二级结构可能会阻止引物结合。建议在20μl的第一链合成反应体系中使用1pmol反义gsp。
11、 提高逆转录保温温度
为了充分利用gsp特异性的全部优点，应该使用有较高热稳定性的逆转录酶。热稳定逆转录酶可以在较高温度保温以增加反应严谨性。比如，如果一个gsp退火温度为55℃，那么如果使用amv或m-mlv在低严谨性的37℃进行逆转录，gsp所带有的特异性就没有利用。然而某些特别的逆转录酶可以在50℃或更高进行反应，这就会消除较低温度时产生的非特异性产物。为获得最大的特异性，可以将rna/引物混合物直接从65℃变性温度转移到逆转录保温温度。这有助于防止低温时分子间碱基配对。使用pcr仪可以简化rt-pcr所需的多种温度转换。
12、 减少基因组dna污染
rt-pcr所遇到的一个潜在的困难是rna中沾染的基因组dna。使用较好的rna分离方法，如trizol，会减少rna制备物中沾染的基因组dna。为了避免产生于基因组dna的产物，可以在逆转录之前使用扩增级的dnaseⅰ对rna进行处理以除去沾染的dna。将样品在2.0mm edta中65℃保温10分钟以终止dnaseⅰ消化。edta可以螯合镁离子，防止高温时所发生的依赖于镁离子的rna水解。
为了将扩增的cdna同沾染的基因组dna扩增产物分开，可以设计分别同分开的外显子退火的引物。来源于cdna的pcr产物会比来源于沾染的基因组dna的产物短。另外对每个rna模板进行一个无逆转录的对照实验，以确定一个给定片段是来自基因组dna还是cdna。在无逆转录时所得到的pcr产物来源于基因组。
热式质量流量计选型
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