大肠杆菌表达外源蛋白的策略
大肠杆菌表达系统是发展zui早、目前zui为成熟的表达系统。因其遗传背景清楚、繁殖快、成本低、表达量高、表达产物容易纯化、稳定性好、抗污染能力强以及适用范围广等，是基础研究和商业生产重组蛋白的强大工具；但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点：如重组蛋白不稳定，生物活性低，以包涵体形式表达。外源基因在大肠杆菌中的表达效率受多个因素的影响，在表达前对目的蛋白进行分析和优化，才能实现目的蛋白的表达，主要包括如下几个方面：
(1) 表达载体的选择，表达载体启动子的选择很重要，启动子的结构影响了它与 rna 聚合酶的亲和力，从而影响了基因表达的水平，理想的启动子应该满足：①具有强启动性，能指导转录以保证目的蛋白的高产量；②可严谨调控，在一定条件下开始诱导表达，可zui大限度降低细菌的代谢负荷和外源蛋白的毒性作用。其他如 sd 序列位置和转录终止子，也会影响转录和翻译效率。
(2) 密码子优化，含有大量稀有密码子的基因在大肠杆菌中表达时，由于大肠杆菌缺乏某几种 trna，会降低 mrna 的翻译效率和稳定性，甚至会造成翻译错误或提前中止。对目的基因进行密码子改造，可以提高 mrna 的稳定性和翻译效率。
(3) 融合蛋白及分子伴侣，融合蛋白不仅可以作为亲和标签利于下游纯化操作，而且大分子融合蛋白还能增加蛋白的可溶性表达，如*-s 转移酶 (gst),sumo 蛋白，麦芽糖结合蛋白（mbp），亲水性强，有助于提高靶蛋白的可溶性和稳定性；共表达分子伴侣可促进重组蛋白的翻译后折叠加工，提高蛋白可溶性和稳定性。大肠杆菌系统中常用的有 groel 和 groes 体系；热休克蛋白 dnak，dnaj 和 grpe 三元体系；dsb 家族 (二硫键还原酶及异构酶)，能够促进二硫键的形成。
(4) 靶蛋白的定位表达，重组蛋白在大肠杆菌中合成后有 4 种定位, 即胞质、周质空间、内膜或外膜和细胞外基质中。利用信号肽将重组蛋白分泌到细胞周质或胞外培养基中, 细胞周质空间的氧化环境利于二硫键的形成和硫基蛋白的正确折叠；周质空间中的蛋白酶要比胞内低很多，减少靶蛋白的降解；周质空间中的蛋白数量也较胞内少很多，利于靶蛋白的纯化。
(5) 表达菌株的选择，菌株内源的蛋白酶过多，可能会造成外源表达产物的不稳定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为理想的起始表达菌株。rosetta2 系列补充大肠杆菌缺乏的七种稀有密码子对应的 trna（aua, agg, aga, cua, ccc,gga 及 cgg），提高外源基因、尤其是真核基因在原核系统中的表达水平；k-12 衍生菌 origami 2 系列，trxb 和 gor 双突变菌株，显著提高细胞质中二硫键形成几率，促进蛋白可溶性表达。rosetta-gami™则是综合上述两类菌株的优点，既补充 7 种稀有密码子，又能够促进二硫键的形成，帮助表达需要借助二硫键形成正确折叠构象的真核蛋白。
(6) 诱导条件，培养条件对重组蛋白的表达也很关键的，例如温度，温度较高时蛋白表达量高但容易形成包涵体，而温度低时蛋白表达量低，但可以提高目的蛋白的可溶性；诱导物的浓度也同样影响重组蛋白的表达效率，如低浓度 iptg 诱导可以提高可溶蛋白的含量。另外培养基的营养成分，ph 和其它参数都可以影响蛋白酶的活性，分泌和表达水平。
在大肠杆菌中表达外源蛋白，表达前的分析非常重要，对目的基因和蛋白进行具体分析，综合考虑，选择的表达体系和方法，才能实现外源蛋白的表达。
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(2) 密码子优化，含有大量稀有密码子的基因在大肠杆菌中表达时，由于大肠杆菌缺乏某几种 trna，会降低 mrna 的翻译效率和稳定性，甚至会造成翻译错误或提前中止。对目的基因进行密码子改造，可以提高 mrna 的稳定性和翻译效率。
(3) 融合蛋白及分子伴侣，融合蛋白不仅可以作为亲和标签利于下游纯化操作，而且大分子融合蛋白还能增加蛋白的可溶性表达，如*-s 转移酶 (gst),sumo 蛋白，麦芽糖结合蛋白（mbp），亲水性强，有助于提高靶蛋白的可溶性和稳定性；共表达分子伴侣可促进重组蛋白的翻译后折叠加工，提高蛋白可溶性和稳定性。大肠杆菌系统中常用的有 groel 和 groes 体系；热休克蛋白 dnak，dnaj 和 grpe 三元体系；dsb 家族 (二硫键还原酶及异构酶)，能够促进二硫键的形成。
(4) 靶蛋白的定位表达，重组蛋白在大肠杆菌中合成后有 4 种定位, 即胞质、周质空间、内膜或外膜和细胞外基质中。利用信号肽将重组蛋白分泌到细胞周质或胞外培养基中, 细胞周质空间的氧化环境利于二硫键的形成和硫基蛋白的正确折叠；周质空间中的蛋白酶要比胞内低很多，减少靶蛋白的降解；周质空间中的蛋白数量也较胞内少很多，利于靶蛋白的纯化。
(5) 表达菌株的选择，菌株内源的蛋白酶过多，可能会造成外源表达产物的不稳定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为理想的起始表达菌株。rosetta2 系列补充大肠杆菌缺乏的七种稀有密码子对应的 trna（aua, agg, aga, cua, ccc,gga 及 cgg），提高外源基因、尤其是真核基因在原核系统中的表达水平；k-12 衍生菌 origami 2 系列，trxb 和 gor 双突变菌株，显著提高细胞质中二硫键形成几率，促进蛋白可溶性表达。rosetta-gami™则是综合上述两类菌株的优点，既补充 7 种稀有密码子，又能够促进二硫键的形成，帮助表达需要借助二硫键形成正确折叠构象的真核蛋白。
(6) 诱导条件，培养条件对重组蛋白的表达也很关键的，例如温度，温度较高时蛋白表达量高但容易形成包涵体，而温度低时蛋白表达量低，但可以提高目的蛋白的可溶性；诱导物的浓度也同样影响重组蛋白的表达效率，如低浓度 iptg 诱导可以提高可溶蛋白的含量。另外培养基的营养成分，ph 和其它参数都可以影响蛋白酶的活性，分泌和表达水平。
在大肠杆菌中表达外源蛋白，表达前的分析非常重要，对目的基因和蛋白进行具体分析，综合考虑，选择的表达体系和方法，才能实现外源蛋白的表达。
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