农业农村部公告第627号-2-2022 饲料中二羟丙茶碱的测定
中华人民共和国国家标准
农业农村部公告第627号-2-2022
饲料中二羟丙茶碱的测定液相色谱-串联质谱法
determination of diprophylline in feeds-
liquid chromatography-tandem mass spectrometry
1范围
本文件规定了饲料中二羟丙茶碱的液相色谱-串联质谱测定方法。
本文件适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和添加剂预混合饲料中二羟丙茶碱的测定。
本文件的检出限为0.01 mg/kg，定量限为0.05 mg/kg。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
gb/t 6682分析实验室用水规格和试验方法
gb/t 20195动物饲料、试样的制备
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义
4原理
试样中的二羟丙茶碱用酸溶被提取，经固相萃取柱净化，用液相色谱-串联质谱仪测定，基质匹配标准溶液校准，外标法定量。
5试剂或材料
除非另有规定，仅使用分析纯试剂。
5.1水：gb/t 6682，一级。
5.2甲醇：色谱纯。
5.3甲酸：色谱纯。
5.4乙酸铵：色谱纯。
5.5 25%甲醇溶液：取甲醇250 ml，加水稀释至1l，混匀。
5.6 0.2%甲酸溶液：取甲酸2ml加水稀释至上1l，混匀。
5.7乙酸铵溶液（200mmol/l）：称取乙酸铵3.1g加水溶解并稀释至200ml，混匀。
5.8乙酸铵-甲酸溶液：移取乙酸铵溶液（5.7）12.5 ml和甲酸1 ml，加水定容至500 ml，混匀。
5.9标准储备溶液（1mg/ml）：准确称取二羟丙茶碱标准品（cas号：479-18-5，纯度不低于98%）50 mg（精确至0.01 mg）于50 ml容量瓶中，用25%甲醇溶液（5.5）溶解定容。于2℃~8℃保存，有效期为3个月。
5.10标准中间溶液（10μg/ml）：准确移取二羟丙茶碱标准储备溶液（5.9）1 ml于100 ml容量瓶中，用甲醇（5.2）稀释至刻度，混匀。于2℃~8℃保存，有效期为1个月。
5.11固相萃取柱：混合型阳离子交换柱，60 mg/3 ml，或性能相当者。
5.12微孔滤膜：0.22μm，水系。
6仪器设备
6.1液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源。
6.2分析天平：感量0.1 mg和0.01 mg。
6.3离心机：转速不低于8 000 r/min。
6.4往复式振荡器。
6.5固相萃取装置。
6.6涡旋混合器。
6.7氮吹仪。
7样品
按gb/t 20195的规定制备试样，至少200g，粉碎后通过0.425mm孔筛，充分混匀，装入容器，密闭保存，备用。选取类型相同，均匀一致、且在待测物保留时间处，仪器响应值小于方法定量限30%的饲料样品，作为空白试样。
8试验步骤
8.1提取
平行做2份试验。称取试样2 g（精确至0.000 1 g），于50 ml离心管中，准确加入20 ml 0.2%甲酸溶液（5.6），播匀，振荡20 min，以8 000 r/min离心5 min，移取上清液作为备用液。
8.2净化
8.2. 1配合饲料、浓缩饲料和精料补充料：将固相萃取柱依次用3 ml甲醇（5.2）、3 ml水活化。准确移取5mi备用液（8.1）过柱，用3ml水淋洗，抽干，再用3ml甲醇（5.2）洗脱，收集洗脱液，于50℃氮吹至干，准确加入1 ml 0.2%甲酸溶液（5.6）溶解，涡旋混匀，过0.22μm微孔滤膜（5.12），备用。
8.2.2添加剂预混合饲料：取适量备用液（8.1）过0.22μm微孔滤膜（5.12）2次，备用。
8.3基质匹配标准系列溶液的制备
取空白试样，按8.1和8.2处理得到空白基质溶液，取适量标准中间溶液（5.10），用甲醇配制成浓度分别为2.0 ng/ml、5.0 ng/ml、25.0 ng/ml、50.0 ngml、100.0 ng/ml、200.0 ng/ml、500.0 ng/ml的标准系列溶液，各取1ml于50℃氦吹至干，准确加入1ml空白基质溶液，涡旋混匀，待测。
8.4测定
8.4.1液相色谱参考条件
色谱柱：c18柱，柱长50mm，内径2.1mm，粒径1.8μm，或性能相当者。
流动相a：甲醇（5.2）；流动相b：乙酸铵-甲酸溶液（5.8）。梯度洗脱条件见表1。
流速：0.3 ml/min。
柱温：30℃。
进样量：2μl。
8.4.2质谱参考条件
电离方式：电喷雾电离，正离子模式（esi+）。
检测方式：多反应监测（mrm）。
毛细管电压：3.5 kv。
干燥气温度：300℃。
干燥气流速：5l/min。
雾化器压力：45 psi。
多反应监测（mrm）离子对、碎裂电压和碰撞能量参考值见表2。
8.4.3基质匹配标准系列溶液和试样溶液测定
在仪器的最佳条件下，分别取基质匹配标准系列溶液和试样溶液上机测定。基质匹配标准溶液多反应监测色谱图见附录a。
8.4.4定性
在相同试验条件下，试样溶液与基质匹配标准系列溶液中待测物的保留时间相对偏差在±2.5%以内，且试样谱图中二羟丙茶碱定性离子的相对离子丰度与浓度接近的标准系列溶液中对应的定性离子相对离子丰度进行比较，若偏差不超过表3规定的范围，则可判定为试样中存在对应的待测物。
8.4.5定量
分别取适量试样溶液和基质匹配标准系列溶液，以浓度为横坐标、色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，标准山线的相关系数应不低于0.99。试样溶液与基质匹配标准溶液中待测物的响应值均应在仪器检测的线性范围内，如超出线性范围，应重新试验或将试样溶液和基质匹配标准溶液用0.2%甲酸溶液稀释后重新测定。单点校准定量时，试样溶液中待测物的浓度与基质匹配标准溶液浓度相差不超过30%。
9试验数据处理
试样中二羟丙茶碱的含量以质量分数计。标准曲线校准按公式（1）计算；单点校准按公式（2）计算。
式中：
ω——试样中二羟丙茶碱含量的数值，单位为毫克/千克（mg/kg）；
ρ——由标准曲线得到的试样溶液中二羟丙茶碱质量浓度的数值，单位为纳克每毫升（ng/ml）；
v——最终定容体积的数值，单位为毫升（ml）；
n——稀释倍数；
m——试样质量的数值，单位为克（g）；
a——试样溶液中二羟丙茶碱的色谱峰面积；
cs——基质匹配标准溶液中二羟丙茶碱质量浓度的数值，单位为纳克每毫升（ng/ml）；
as——基质匹配标准溶液中二羟丙茶碱的色谱峰面积。
测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留3位有效数字。
10精密度
在重复性条件下，2次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值不大于该算术平均值的20%。
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下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
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3术语和定义
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试样中的二羟丙茶碱用酸溶被提取，经固相萃取柱净化，用液相色谱-串联质谱仪测定，基质匹配标准溶液校准，外标法定量。
5试剂或材料
除非另有规定，仅使用分析纯试剂。
5.1水：gb/t 6682，一级。
5.2甲醇：色谱纯。
5.3甲酸：色谱纯。
5.4乙酸铵：色谱纯。
5.5 25%甲醇溶液：取甲醇250 ml，加水稀释至1l，混匀。
5.6 0.2%甲酸溶液：取甲酸2ml加水稀释至上1l，混匀。
5.7乙酸铵溶液（200mmol/l）：称取乙酸铵3.1g加水溶解并稀释至200ml，混匀。
5.8乙酸铵-甲酸溶液：移取乙酸铵溶液（5.7）12.5 ml和甲酸1 ml，加水定容至500 ml，混匀。
5.9标准储备溶液（1mg/ml）：准确称取二羟丙茶碱标准品（cas号：479-18-5，纯度不低于98%）50 mg（精确至0.01 mg）于50 ml容量瓶中，用25%甲醇溶液（5.5）溶解定容。于2℃~8℃保存，有效期为3个月。
5.10标准中间溶液（10μg/ml）：准确移取二羟丙茶碱标准储备溶液（5.9）1 ml于100 ml容量瓶中，用甲醇（5.2）稀释至刻度，混匀。于2℃~8℃保存，有效期为1个月。
5.11固相萃取柱：混合型阳离子交换柱，60 mg/3 ml，或性能相当者。
5.12微孔滤膜：0.22μm，水系。
6仪器设备
6.1液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源。
6.2分析天平：感量0.1 mg和0.01 mg。
6.3离心机：转速不低于8 000 r/min。
6.4往复式振荡器。
6.5固相萃取装置。
6.6涡旋混合器。
6.7氮吹仪。
7样品
按gb/t 20195的规定制备试样，至少200g，粉碎后通过0.425mm孔筛，充分混匀，装入容器，密闭保存，备用。选取类型相同，均匀一致、且在待测物保留时间处，仪器响应值小于方法定量限30%的饲料样品，作为空白试样。
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8.2净化
8.2. 1配合饲料、浓缩饲料和精料补充料：将固相萃取柱依次用3 ml甲醇（5.2）、3 ml水活化。准确移取5mi备用液（8.1）过柱，用3ml水淋洗，抽干，再用3ml甲醇（5.2）洗脱，收集洗脱液，于50℃氮吹至干，准确加入1 ml 0.2%甲酸溶液（5.6）溶解，涡旋混匀，过0.22μm微孔滤膜（5.12），备用。
8.2.2添加剂预混合饲料：取适量备用液（8.1）过0.22μm微孔滤膜（5.12）2次，备用。
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8.4.1液相色谱参考条件
色谱柱：c18柱，柱长50mm，内径2.1mm，粒径1.8μm，或性能相当者。
流动相a：甲醇（5.2）；流动相b：乙酸铵-甲酸溶液（5.8）。梯度洗脱条件见表1。
流速：0.3 ml/min。
柱温：30℃。
进样量：2μl。
8.4.2质谱参考条件
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检测方式：多反应监测（mrm）。
毛细管电压：3.5 kv。
干燥气温度：300℃。
干燥气流速：5l/min。
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8.4.4定性
在相同试验条件下，试样溶液与基质匹配标准系列溶液中待测物的保留时间相对偏差在±2.5%以内，且试样谱图中二羟丙茶碱定性离子的相对离子丰度与浓度接近的标准系列溶液中对应的定性离子相对离子丰度进行比较，若偏差不超过表3规定的范围，则可判定为试样中存在对应的待测物。
8.4.5定量
分别取适量试样溶液和基质匹配标准系列溶液，以浓度为横坐标、色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，标准山线的相关系数应不低于0.99。试样溶液与基质匹配标准溶液中待测物的响应值均应在仪器检测的线性范围内，如超出线性范围，应重新试验或将试样溶液和基质匹配标准溶液用0.2%甲酸溶液稀释后重新测定。单点校准定量时，试样溶液中待测物的浓度与基质匹配标准溶液浓度相差不超过30%。
9试验数据处理
试样中二羟丙茶碱的含量以质量分数计。标准曲线校准按公式（1）计算；单点校准按公式（2）计算。
式中：
ω——试样中二羟丙茶碱含量的数值，单位为毫克/千克（mg/kg）；
ρ——由标准曲线得到的试样溶液中二羟丙茶碱质量浓度的数值，单位为纳克每毫升（ng/ml）；
v——最终定容体积的数值，单位为毫升（ml）；
n——稀释倍数；
m——试样质量的数值，单位为克（g）；
a——试样溶液中二羟丙茶碱的色谱峰面积；
cs——基质匹配标准溶液中二羟丙茶碱质量浓度的数值，单位为纳克每毫升（ng/ml）；
as——基质匹配标准溶液中二羟丙茶碱的色谱峰面积。
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10精密度
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