荧光定量PCR的优化方法
使用荧光定量pcr仪进行定量pcr实验时，通常出现效果不佳的情况，下面小编就带你了解一些的pcr实验的优化方法：
一、基本参数的优化
1.1mgcl2的浓度 在pcr反应中，mgcl2的浓度对影响酶的活性是至关重要的，不仅如此，合适的mgcl2的浓度还能在反应中得到较低的cp(crossing point)值，较高的荧光信号强度以及良好的曲线峰值。所以对其的深度选择应慎重
一般来说，对以dna或cdna为模板的pcr反应，应选择2－5 mm浓度的mgcl2，对以mrna为模板的rt－pcr而言，则应选择的浓度为4－8 mm。
1.2模板的浓度：如果研究者是进行实验，那么应选择一系列稀释浓度的模板来进行实验，以选择出最为合适的模板浓度，如果条件困难，也至少要选择两个稀释度（高和中、低浓度）来进行实验。
一般而言，使cp位于15－30个循环比较合适，若大于30则应使用较高的模板浓度，如果cp小于15则应选择较低的模板深度。对于cp值的确定，经验上是sybr green i探针的荧光信号比本底高2倍，杂交探针的荧光强度比本底高0.3倍。
二、使用sybr green i测定dna时的条件优化
2.1mgcl2的浓度：大多数引物－模板对其的要求是2－4 mm。
2.2模板的浓度：初次实验要求做一系列的稀释浓度，如条件限制，至少完成两个稀释的度的测定。基因组dna在50 ng-5 pg之间选择，质粒dna在106拷贝数左右选择。
2.3pcr抑制子：通常用于消除抑制子的办法是将样本进行稀释，但是在某些条件下，抑制子的浓度高，而模板量少，稀释法就不再能达到好的效果，反会使反应的敏感度降低，所以，研究者若要进行实时定量pcr研究，最好选用纯化的模板。
2.4引物的浓度：引物的浓度是一个影响pcr反应的关键因素，其浓度太低，会致使反应不完，若引物太多，则发生错配以及产生非特异的产物的可能性会大大增加。对于大多数pcr反应，0.5 um是个合适的浓度，若初次选用这个浓度不理想，可在0.3－1.0 um之间进行选择，直至达到满意的结果。
2.6退火温度：实验设置的退火温度应比计算得出的tm值小5 ℃，然后在1－2 ℃内进行选择。一般地，退火温度要根据经验来确定，这个经验值往往会同计算得到的tm值有较大的差距。
三、用sybr green i进行一步法rt－pcr的条件优化
3.1mgcl2的浓度：不同的靶分子选用不同的浓度，通常是在4－8 mm之间选择。
3.2模板的浓度：rt－pcr实验既可以选用总rna，又可以选用mrna，其浓度应在1 pg-1 ug之间选择。对于低模板浓度，可以增加适量的ms2或用alternative rna 作为载体进行测定。
3.3对照设置：每一引物都应设有阴性对照，阳性对照和污染对照。
四、杂交探针测定dna
4.1mgcl2的浓度：在2－4 mm的基础上加0.5－1.0 mm，但是不要超过2.0 mm。
4.2杂交探针的浓度：初次实验每个探针用0.2 um，如果信号强度达不到要求，可以增加至0.4 um。
4.3对照设置：每一引物都要设阴性对照，每一探针都要设阴性对照。每次实验都要设阳性对照。
4.4 其它的条件同sybr green i。
五、用杂交探针实时定量rt－pcr
5.1mgcl2的浓度：在4－8 mm之间进行选择。
5.2杂交探针的浓度：初实验用0.2 um，如果荧光信号强度不足，可以增加至0.4 um。
5.3模板浓度设置：优化的扩增须进行一系列知释度的实验，在条件有困难的条件下，至少要进行两个稀释度的测定。选用1pg-1 ug的总rna或是mrna，若是模板的浓度过小（小于10 ng/ul）,则可加入ms2或alternative rna作为载体。
5.4对照设置：每个引物都要设无模板对照，阳性对照以及污染对照。
六、关于杂交探针的评价
在使用杂交探针进行实验时，必须注意防止探针－引物二聚体的形成和其本身在反应过程中的延伸。引物－探针二聚体的形成，主要是因为探针可与引物的3’末端杂交，其形成以后，会致使此二聚体扩增，从而同目的基因竞争反应的原料，致反应的效率下降。
探针其本身能同目的基因相结合，且其解链温度高于引物，所以它可能作为引物而引发延伸反应，为了防止发生这种现象，通常是将其3’末端全磷酸化，使之不能延伸，若此磷酸化不全或是没有磷酸化，就会产生目的基因的副产品，从而干扰实验结果。鉴于以上这两点，所以应对探针精心设计，并将其末端全磷酸化。
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一般来说，对以dna或cdna为模板的pcr反应，应选择2－5 mm浓度的mgcl2，对以mrna为模板的rt－pcr而言，则应选择的浓度为4－8 mm。
1.2模板的浓度：如果研究者是进行实验，那么应选择一系列稀释浓度的模板来进行实验，以选择出最为合适的模板浓度，如果条件困难，也至少要选择两个稀释度（高和中、低浓度）来进行实验。
一般而言，使cp位于15－30个循环比较合适，若大于30则应使用较高的模板浓度，如果cp小于15则应选择较低的模板深度。对于cp值的确定，经验上是sybr green i探针的荧光信号比本底高2倍，杂交探针的荧光强度比本底高0.3倍。
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2.1mgcl2的浓度：大多数引物－模板对其的要求是2－4 mm。
2.2模板的浓度：初次实验要求做一系列的稀释浓度，如条件限制，至少完成两个稀释的度的测定。基因组dna在50 ng-5 pg之间选择，质粒dna在106拷贝数左右选择。
2.3pcr抑制子：通常用于消除抑制子的办法是将样本进行稀释，但是在某些条件下，抑制子的浓度高，而模板量少，稀释法就不再能达到好的效果，反会使反应的敏感度降低，所以，研究者若要进行实时定量pcr研究，最好选用纯化的模板。
2.4引物的浓度：引物的浓度是一个影响pcr反应的关键因素，其浓度太低，会致使反应不完，若引物太多，则发生错配以及产生非特异的产物的可能性会大大增加。对于大多数pcr反应，0.5 um是个合适的浓度，若初次选用这个浓度不理想，可在0.3－1.0 um之间进行选择，直至达到满意的结果。
2.6退火温度：实验设置的退火温度应比计算得出的tm值小5 ℃，然后在1－2 ℃内进行选择。一般地，退火温度要根据经验来确定，这个经验值往往会同计算得到的tm值有较大的差距。
三、用sybr green i进行一步法rt－pcr的条件优化
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3.2模板的浓度：rt－pcr实验既可以选用总rna，又可以选用mrna，其浓度应在1 pg-1 ug之间选择。对于低模板浓度，可以增加适量的ms2或用alternative rna 作为载体进行测定。
3.3对照设置：每一引物都应设有阴性对照，阳性对照和污染对照。
四、杂交探针测定dna
4.1mgcl2的浓度：在2－4 mm的基础上加0.5－1.0 mm，但是不要超过2.0 mm。
4.2杂交探针的浓度：初次实验每个探针用0.2 um，如果信号强度达不到要求，可以增加至0.4 um。
4.3对照设置：每一引物都要设阴性对照，每一探针都要设阴性对照。每次实验都要设阳性对照。
4.4 其它的条件同sybr green i。
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5.3模板浓度设置：优化的扩增须进行一系列知释度的实验，在条件有困难的条件下，至少要进行两个稀释度的测定。选用1pg-1 ug的总rna或是mrna，若是模板的浓度过小（小于10 ng/ul）,则可加入ms2或alternative rna作为载体。
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