蛋白质纯化亲和层析法
若表达蛋白质上含有一段六个his 的片段，而亲和吸附胶上接有镍离子，此蛋白质会特异性地结合到吸着胶体；洗去杂质后可imidazole 洗脱目标蛋白质。（pharmacia 操作手册， affinity chromatography）。
仪器设备：
亲和层析管柱 （bio-rad 731-1550 poly-prep column, 0.8×4 cm）
部分收集器 （另需准备干净试管约25 支）
药品试剂：
金属螯合亲和层析胶体 （ni-nta agarose, qiagen 30210） 1 ml
◆ 在交联琼脂糖凝胶上接有nitrilotriacetic acid （nta） 官能基，可以螯合镍离子；使用前先以镍离子饱和的。
buffer b-300/0 （50 mm na3po4, ph 8.0; 0.3 m nacl）
◆ 使用前才添加成10 mm β-mercaptoethanol.
buffer b-300/20: buffer b-300/0 加有20 mm imidazole
buffer b-300/250: buffer b-300/0 加有250 mm imidazole
方法步骤：
1） 亲和层析胶体1 ml 已经装填在管柱内，成为一淡蓝色胶柱。请把管柱架直在铁架上，去除下方的填塞物，用buffer b-300/0 流洗20 ml 后塞住出口，准备注入样本。
2） 除去胶面上方的缓冲液，并取出样本 （iex） 使其回到室温，慢慢用滴管加到亲和胶体上，小心勿弄乱胶体表面；让样本没入胶体中，同时收集流出液每管2.5 ml.
3） 待样本全部进入胶体后，关闭出口，再慢慢加入buffer b-300/20,打开出口收集流出液；buffer b-300/20 共流洗30 ml.
4） 接着以buffer b-300/250 流洗30 ml,方法同上，收集。
5） 所有收集均定量蛋白质并测定酶活性，取收集酶活性zui高的数个，共得 _______ ml （af），保留100 μl 以供分析。
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buffer b-300/0 （50 mm na3po4, ph 8.0; 0.3 m nacl）
◆ 使用前才添加成10 mm β-mercaptoethanol.
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1） 亲和层析胶体1 ml 已经装填在管柱内，成为一淡蓝色胶柱。请把管柱架直在铁架上，去除下方的填塞物，用buffer b-300/0 流洗20 ml 后塞住出口，准备注入样本。
2） 除去胶面上方的缓冲液，并取出样本 （iex） 使其回到室温，慢慢用滴管加到亲和胶体上，小心勿弄乱胶体表面；让样本没入胶体中，同时收集流出液每管2.5 ml.
3） 待样本全部进入胶体后，关闭出口，再慢慢加入buffer b-300/20,打开出口收集流出液；buffer b-300/20 共流洗30 ml.
4） 接着以buffer b-300/250 流洗30 ml,方法同上，收集。
5） 所有收集均定量蛋白质并测定酶活性，取收集酶活性zui高的数个，共得 _______ ml （af），保留100 μl 以供分析。
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