PCR技术基本原理
1.pcr技术基本原理
pcr技术的基本原理 类似于dna的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。pcr由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板dna的变性：模板dna经加热至93℃左右一定时间后，使模板dna双链或经pcr扩增形成的双链dna解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板dna与引物的退火(复性)：模板dna经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板dna单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：dna模板--引物结合物在taqdna聚合酶的作用下，以dntp为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板dna 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基蚶┰龇糯蠹赴偻虮丁５酱锲教ㄆ?plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
pcr的反应动力学 pcr的三个反应步骤反复进行，使dna扩增量呈指数上升。反应最终的dna 扩增量可用y＝(1＋x)n计算。y代表dna片段扩增后的拷贝数，x表示平(y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列dna片段的增加呈指数形式，随着pcr产物的逐渐积累，被扩增的dna片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、pcr扩增效率及dna聚合酶pcr的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。
pcr扩增产物 可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的dna为模板，引物是从3’端开始延伸，其5’端是固定的，3’端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的5’端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3’端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计， 这使得pcr的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯dna片段供分析与检测用。
2.pcr反应体系与反应条件
标准的pcr反应体系：
10×扩增缓冲液 10ul
4种dntp混合物 各200umol/l
引物 各10～100pmol
模板dna 0.1～2ug
taq dna聚合酶 2.5u
mg2+ 1.5mmol/l
加双或三蒸水至 100ul
pcr反应五要素： 参加pcr反应的物质主要有五种即引物、酶、dntp、模板和mg2+
引物： 引物是pcr特异性反应的关键，pcr 产物的特异性取决于引物与模板dna互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板dna序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用pcr就可将模板dna在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：
①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：g+c含量以40-60%为宜，g+c太少扩增效果不佳，g+c过多易出现非特异条带。atgc最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致pcr失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
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pcr的反应动力学 pcr的三个反应步骤反复进行，使dna扩增量呈指数上升。反应最终的dna 扩增量可用y＝(1＋x)n计算。y代表dna片段扩增后的拷贝数，x表示平(y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列dna片段的增加呈指数形式，随着pcr产物的逐渐积累，被扩增的dna片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、pcr扩增效率及dna聚合酶pcr的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。
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③引物碱基：g+c含量以40-60%为宜，g+c太少扩增效果不佳，g+c过多易出现非特异条带。atgc最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致pcr失败。
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