新技术传递----Nicoya 新一代SPR 技术在钙调蛋白与NOS研究中的应用 EF手性对突变钙调蛋白与一氧化氮合酶结合域肽段相互作用研究
新技术传递----nicoya 新一代spr 技术在钙调蛋白与nos研究中的应用
ef手性对突变钙调蛋白与一氧化氮合酶结合域肽段相互作用研究
department of chemistry, university of waterloo, waterloo, ontario n2l 3g1, canada
一氧化氮合酶(nos)是一种非常重要的生物小分子no合成催化酶，一氧化氮合（nos）包括三个同型酶：神经酶（nnos）、内皮型一氧化氮合酶（enos）以及诱导型一氧化氮合酶（inos）。每种酶产生的no分别用于神经传递、血管舒张和免疫应答。一氧化氮合酶是通过钙调蛋白结构阈将n末端氧化酶结构域和c-末端结合域形成的同源二聚体蛋白。
一氧化氮合酶（nos）能催化l-生成no及在几个关键的生理过程中起主要作用，钙调蛋白（cam）是小的泛素化ca+2偶联蛋白，用于激活（nos）;钙调蛋白通过ef手性变化与ca+2结合，但钙调蛋白激活nos的机制还不清楚.
目前用于cam与nos 相互作用研究方法较为复杂、耗时。为此，加拿大waterloo大学的john通过niocya 公司开发的lspr 实时无标记检测技术分析了不同ef手性对突变的cam与nos相互作用，对比cam与nos 的结合亲和力，对通过简单方法获得的 cam-nos作用结果进行了动力学数据不错，揭示cam通过ef手性对突变激活nos！ 并将该成果与研究方法在2017化学生物物理学研讨会进行了分享。
cam是一种体积小且高度动态的,具有催化ca2+结合的蛋白，几乎存在所有真核生物体中，它对激活nos的活性是必要的。它由一个可变的中心连接子区连接的球状n末端和c-末端结构域构成，每个区域cam 通过2对ef-手性基序与ca2+结合，可以结合4个ca2+，这些基序对于相互结合及nos的活性是必须存在的 。
图为：cam 的ca2+不同结合状态（a）apo-cam (b) holo-cam (c) holo-cam结构紧凑
图为：不同的cam ef-手性突变后结构示意图
l 根据之前实验获取的一些信息，john团队利用nicoya 的lspr 技术产品openspr实时无标记技
术对cam与nos的激活机制做检测；实验过程先对经电泳验证过表达的cam纯化并做了质量鉴定，之后用于与nos相互作用研究。
cam纯化后sds-page 分析结果
蛋白结合分析： 将 nos固定openspr的纳米金芯片表面，并对cam做浓度梯度检测，结果导入tracedrawer分析。
openspr实时检测，梯度稀释后不同浓度检测出野生型cam对nnos（红线）和enos 肽（紫红线）的结合情况，观察结合、解离及再生的整个过程，结果显示实验曲线稳定及信号显著。
不同突变的cam 与cnos结合数据导入trace drawer 软件分析，获取koff、 kon及 kd值，结果如下：
结果显示：camcc与cnos 的亲和力高于wt cam,相对wt cam，所有突变型的cam除了ncam及camcc,与nos解离速率都加快，并且结果与之前传统方法得出只有camc能激活nos，其他激活效果差或不激活的结果一致，也有效的证明了openspr 在cam 与cnos结合研究中的准确性，并且检测方法简单，数据结果丰富，阐述了cam激活cnos激活机制是因cam发生了ef手性对突变，利用这个方法下一步继续验证cam激活enos及inos 的机制。
(1)alderton etal.biochem.j. (2001)357:593
(2) babu ys,bugg ce ,cook wj:j.mol.bio.(1988)204:191-204
(3) spratt.d.e.et febs(2006)273,1759-1771
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一氧化氮合酶（nos）能催化l-生成no及在几个关键的生理过程中起主要作用，钙调蛋白（cam）是小的泛素化ca+2偶联蛋白，用于激活（nos）;钙调蛋白通过ef手性变化与ca+2结合，但钙调蛋白激活nos的机制还不清楚.
目前用于cam与nos 相互作用研究方法较为复杂、耗时。为此，加拿大waterloo大学的john通过niocya 公司开发的lspr 实时无标记检测技术分析了不同ef手性对突变的cam与nos相互作用，对比cam与nos 的结合亲和力，对通过简单方法获得的 cam-nos作用结果进行了动力学数据不错，揭示cam通过ef手性对突变激活nos！ 并将该成果与研究方法在2017化学生物物理学研讨会进行了分享。
cam是一种体积小且高度动态的,具有催化ca2+结合的蛋白，几乎存在所有真核生物体中，它对激活nos的活性是必要的。它由一个可变的中心连接子区连接的球状n末端和c-末端结构域构成，每个区域cam 通过2对ef-手性基序与ca2+结合，可以结合4个ca2+，这些基序对于相互结合及nos的活性是必须存在的 。
图为：cam 的ca2+不同结合状态（a）apo-cam (b) holo-cam (c) holo-cam结构紧凑
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蛋白结合分析： 将 nos固定openspr的纳米金芯片表面，并对cam做浓度梯度检测，结果导入tracedrawer分析。
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不同突变的cam 与cnos结合数据导入trace drawer 软件分析，获取koff、 kon及 kd值，结果如下：
结果显示：camcc与cnos 的亲和力高于wt cam,相对wt cam，所有突变型的cam除了ncam及camcc,与nos解离速率都加快，并且结果与之前传统方法得出只有camc能激活nos，其他激活效果差或不激活的结果一致，也有效的证明了openspr 在cam 与cnos结合研究中的准确性，并且检测方法简单，数据结果丰富，阐述了cam激活cnos激活机制是因cam发生了ef手性对突变，利用这个方法下一步继续验证cam激活enos及inos 的机制。
(1)alderton etal.biochem.j. (2001)357:593
(2) babu ys,bugg ce ,cook wj:j.mol.bio.(1988)204:191-204
(3) spratt.d.e.et febs(2006)273,1759-1771
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