GB 31658.23-2022 动物性食品中硝基咪唑类药物残留量的测定
中华人民共和国国家标准
gb 31658.23-2022
食品安全国家标准
动物性食品中硝基咪唑类药物残留量的测定
液相色谱-串联质谱法
national food safety standard-
determination of nitroimidazole residues in animal derived food
by liquid chromatography-tandem mass spectrometric method
1范围
本文件规定了动物性食品中甲硝唑、羟基甲硝唑、地美硝唑和羟基地美硝唑残留量检测的制样和液相色谱-串联质谱测定方法。
本文件适用于猪、牛、羊和鸡的肌肉、肝脏和肾脏组织中甲硝唑、羟基甲硝唑、地美硝唑和羟基地美硝唑残留量的测定。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
gb/t 6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4原理
试样中残留的硝基咪唑类药物经乙酸乙酯提取，正己烷液液萃取除脂，固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱检测，基质匹配内标法定量。
5试剂与材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为符合gb/t 6682规定的一级水。
5.1试剂
5.1.1乙酸乙酯(c4h8o2)：色谱纯。
5. 1.2乙腈(ch3cn)：色谱纯。
5.1.3甲醇(ch3oh)：色谱纯。
5. 1.4正己烷(c6h14)：色谱纯。
5. 1.5甲酸(hcooh)：色谱纯。
5. 1.6氨水(nh3·h2o)。
5.1.7盐酸(hcl)。
5.2溶液配制
5.2.1 0.1 mol/l盐酸溶液：取浓盐酸8.3 ml，加水稀释至1 l，混匀。
5.2.2 2%氨水溶液：取氨水2ml，加水稀释至100ml，混匀，现用现配。
5.2.3洗脱液：取甲醇80 ml，加水15 ml、氨水5 ml，混匀，现用现配。
5.2.4 0.1%甲酸水溶液：取水500ml，加甲酸500μl，混匀。
5.2.5 0.1%甲酸乙腈溶液：取乙腈500ml，加甲酸500μl，混匀。
5.3标准品
甲硝唑、地美硝唑、羟基甲硝唑、羟基地美硝唑、甲硝唑-d3、地美硝唑-d3、羟基甲硝唑-d2、羟基地美硝唑-d3，含量均≥95%。具体见附录a。
5.4标准溶液制备
5.4.1标准储备液：取甲硝唑、地美硝唑、羟基甲硝唑、羟基地美硝唑标准品适量(相当于各有效成分10 mg)，精密称定，用甲醇溶解并稀释定容于10 ml容量瓶，配制成浓度为1 mg/ml的甲硝唑、地美硝唑、羟基甲硝唑和羟基地美硝唑标准储备液。-18℃以下保存，有效期6个月。
5.4.2内标储备液：取甲硝唑-d3、地美硝唑-d3、羟基甲硝唑-d2和羟基地美硝唑-d3，标准品适量(相当于各有效成分10 mg)，精密称定，用甲醇溶解并稀释定容于10 ml容量瓶，配制成浓度为1 mg/ml的甲硝唑-d3、地美硝唑-d3、羟基甲硝唑-d2和羟基地美硝唑-d3内标储备液。-18℃以下保存，有效期6个月。
5.4.3 10μg/ml混合标准工作液：分别精密量取标准储备液各0.1ml于10ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度为10μg/ml的混合标准工作液。-18℃以下保存，有效期6个月。
5.4.4 1μg/ml混合标准工作液：精密量取10μg/ml混合标准工作液1 ml于10 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度为1μg/ ml的混合标准工作液。- 18℃以下保存，有效期3个月。
5.4.5 0.1μg/ml混合标准工作液：精密量取1μg/ml混合标准工作液1 ml于10 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度为0.1μg/ml的混合标准工作液。- 18℃以下保存，有效期1个月。
5.4.6 10μg/ml混合内标工作液：分别精密量取内标储备液各0.1 ml于10 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度为10μg/ml的混合内标工作液。-18℃以下保存，有效期6个月。
5.4.7 1μg/ml混合内标工作液：精密量取10μg/ml内标工作液1 ml于10 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度为1μg/ml的混合内标工作液。-18℃以下保存，有效期3个月。
5.5材料
5.5.1混合型强阳离子交换反相固相萃取柱：60mg/3ml，或相当者。
5.5.2微孔滤膜：0.2μm，水相。
6仪器和设备
6.1液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源。
6.2分析天平：感量0.0001 g和0.01 g。
6.3氮吹仪。
6.4涡旋混合器。
6.5离心机。
6.6组织匀浆机。
6.7固相萃取装置。
7试样的制备与保存
7.1试样的制备
取适量新鲜或解冻的空白或供试组织，绞碎，并均质。
a)取均质后的供试样品，作为供试试样；
b)取均质后的空白样品，作为空白试样；
取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准溶液，作为空白添加试料。
7.2试样的保存
-18℃以下保存。
8测定步骤
8.1提取
称取试样2g(准确至±0.05g)，于50 ml塑料离心管，加1μg/ml混合内标工作液10μl，涡旋30 s混匀，静置10 min。加乙酸乙酯15 ml，涡旋2 min，10 000 r/min离心5 min。取上清液于另一50 ml离心管中，残渣中加乙酸乙酯15 ml，重复提取一次，合并2次提取液，于25℃水浴氮气吹干。
8.2净化
残余物中加0.1 mol/l盐酸溶液5 ml，涡旋1 min充分溶解，加正己烷5 ml，振摇1 min，5 000 r/ min离心5 min，弃正己烷层。下层再加正己烷5 ml重复除脂-次，弃正己烷层，备用。
固相萃取柱依次用甲醇2 ml和0.1 mol/l盐酸溶液2 ml活化，取备用液过柱，依次用0.1 mol/l盐酸溶液2 ml、甲醇1 ml和2%氨水1 ml淋洗，用洗脱液2 ml洗脱。收集洗脱液，35℃水浴氮气吹干，残余物中加水0.5ml涡旋1min，滤膜过滤，供液相色谱-串联质谱测定。
8.3基质匹配标准曲线的制备
取经提取和净化的空白试料溶液，加入适量的混合标准工作液和1μg/ml混合内标工作液10μl，35℃水浴氮气吹干，加水0.5 ml涡旋1 min，配制成浓度为2μg/l、4μg/l、20μg/l、40μg/l、200μg/l和400μg/l的基质匹配标准溶液，过滤后供液相色谱-串联质谱测定。以测得的硝基咪唑类药物与相应内标的特征离子峰面积之比为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。
8.4测定
8. 4.1液相色谱参考条件
a)色谱柱：c18色谱柱(50 mm×2.1 mm，1.7μm)或相当者；
b)流动相：a为0. 1%的甲酸水溶液，b为0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脱程序见表1；
c)流速：0.3 ml/min；
d)柱温：30℃；
e)进样量：10μl。
8.4.2质谱参考条件
a)离子源：电喷雾(esi)离子源；
b)扫描方式：正离子扫描；
c)检测方式：多反应监测；
d)喷雾电压：3 000 v；
e)雾化温度：350℃；
f)源温：100℃；
g)锥孔气流速：30 l/h；
h)雾化气流速：600 l/h；
i)待测药物定性离子对、定量离子对、锥孔电压和碰撞能量的参考值见表2。
8. 4.3测定法
8.4.3. 1定性测定
在同样测试条件下，试料溶液中硝基咪唑类药物的保留时间与基质四配标准工作液中硝基咪唑类药物的保留时间之比，偏差在±2.5%以内，且检测到的相对离子丰度，应当与浓度相当的基质匹配标准溶液离子相对丰度一致。其允许偏差应符合表3要求。
8.4.3.2定量测定
取试料溶液和基质匹配标准工作液，作单点或多点校准，按内标法定量。基质匹配标准工作液及试料溶液中目标物的响应值均应在仪器检测的线性范围内。在上述色谱质谱条件下，标准溶液特征离子质量色谱图见附录b。
8.5空白试验
取空白试料，除不加药物外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。
9结果计算和表述
试样中硝基咪唑类药物的残留量按标准曲线或公式(1)计算。
式中：
x——试样中硝基咪唑类药物残留量的数值，单位为微克每千克(μg/kg)；
a——供试试样溶液中硝基咪唑类药物的峰面积；
a'is——基质匹配标准溶液中内标的峰面积；
cs——基质匹配标准溶液中硝基咪唑类药物浓度的数值，单位为微克每升(μg/l)；
cis——供试试样中内标浓度的数值，单位为微克每升(μg/l)；
v——供试试样最终定容体积的数值，单位为毫升(ml)；
ais——供试试样溶液中内标的峰面积；
as——基质匹配标准溶液中硝基咪唑类药物的峰面积；
c'is——基质匹配标准溶液中内标浓度的数值，单位为微克每升(μg/l)；
m——供试试样质量的数值，单位为克(g)。
10方法灵敏度、准确度和精密度
10.1灵敏度
本方法的检测限为0.5μg/kg，定量限为1μg/kg。
10.2准确度
本方法在1μg/kg~10μg/kg添加浓度水平上的回收率为60%~120%。
10.3精密度
本方法批内相对标准偏差≤20%，批间相对标准偏差≤20%。
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1范围
本文件规定了动物性食品中甲硝唑、羟基甲硝唑、地美硝唑和羟基地美硝唑残留量检测的制样和液相色谱-串联质谱测定方法。
本文件适用于猪、牛、羊和鸡的肌肉、肝脏和肾脏组织中甲硝唑、羟基甲硝唑、地美硝唑和羟基地美硝唑残留量的测定。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
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3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4原理
试样中残留的硝基咪唑类药物经乙酸乙酯提取，正己烷液液萃取除脂，固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱检测，基质匹配内标法定量。
5试剂与材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为符合gb/t 6682规定的一级水。
5.1试剂
5.1.1乙酸乙酯(c4h8o2)：色谱纯。
5. 1.2乙腈(ch3cn)：色谱纯。
5.1.3甲醇(ch3oh)：色谱纯。
5. 1.4正己烷(c6h14)：色谱纯。
5. 1.5甲酸(hcooh)：色谱纯。
5. 1.6氨水(nh3·h2o)。
5.1.7盐酸(hcl)。
5.2溶液配制
5.2.1 0.1 mol/l盐酸溶液：取浓盐酸8.3 ml，加水稀释至1 l，混匀。
5.2.2 2%氨水溶液：取氨水2ml，加水稀释至100ml，混匀，现用现配。
5.2.3洗脱液：取甲醇80 ml，加水15 ml、氨水5 ml，混匀，现用现配。
5.2.4 0.1%甲酸水溶液：取水500ml，加甲酸500μl，混匀。
5.2.5 0.1%甲酸乙腈溶液：取乙腈500ml，加甲酸500μl，混匀。
5.3标准品
甲硝唑、地美硝唑、羟基甲硝唑、羟基地美硝唑、甲硝唑-d3、地美硝唑-d3、羟基甲硝唑-d2、羟基地美硝唑-d3，含量均≥95%。具体见附录a。
5.4标准溶液制备
5.4.1标准储备液：取甲硝唑、地美硝唑、羟基甲硝唑、羟基地美硝唑标准品适量(相当于各有效成分10 mg)，精密称定，用甲醇溶解并稀释定容于10 ml容量瓶，配制成浓度为1 mg/ml的甲硝唑、地美硝唑、羟基甲硝唑和羟基地美硝唑标准储备液。-18℃以下保存，有效期6个月。
5.4.2内标储备液：取甲硝唑-d3、地美硝唑-d3、羟基甲硝唑-d2和羟基地美硝唑-d3，标准品适量(相当于各有效成分10 mg)，精密称定，用甲醇溶解并稀释定容于10 ml容量瓶，配制成浓度为1 mg/ml的甲硝唑-d3、地美硝唑-d3、羟基甲硝唑-d2和羟基地美硝唑-d3内标储备液。-18℃以下保存，有效期6个月。
5.4.3 10μg/ml混合标准工作液：分别精密量取标准储备液各0.1ml于10ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度为10μg/ml的混合标准工作液。-18℃以下保存，有效期6个月。
5.4.4 1μg/ml混合标准工作液：精密量取10μg/ml混合标准工作液1 ml于10 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度为1μg/ ml的混合标准工作液。- 18℃以下保存，有效期3个月。
5.4.5 0.1μg/ml混合标准工作液：精密量取1μg/ml混合标准工作液1 ml于10 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度为0.1μg/ml的混合标准工作液。- 18℃以下保存，有效期1个月。
5.4.6 10μg/ml混合内标工作液：分别精密量取内标储备液各0.1 ml于10 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度为10μg/ml的混合内标工作液。-18℃以下保存，有效期6个月。
5.4.7 1μg/ml混合内标工作液：精密量取10μg/ml内标工作液1 ml于10 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成浓度为1μg/ml的混合内标工作液。-18℃以下保存，有效期3个月。
5.5材料
5.5.1混合型强阳离子交换反相固相萃取柱：60mg/3ml，或相当者。
5.5.2微孔滤膜：0.2μm，水相。
6仪器和设备
6.1液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源。
6.2分析天平：感量0.0001 g和0.01 g。
6.3氮吹仪。
6.4涡旋混合器。
6.5离心机。
6.6组织匀浆机。
6.7固相萃取装置。
7试样的制备与保存
7.1试样的制备
取适量新鲜或解冻的空白或供试组织，绞碎，并均质。
a)取均质后的供试样品，作为供试试样；
b)取均质后的空白样品，作为空白试样；
取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准溶液，作为空白添加试料。
7.2试样的保存
-18℃以下保存。
8测定步骤
8.1提取
称取试样2g(准确至±0.05g)，于50 ml塑料离心管，加1μg/ml混合内标工作液10μl，涡旋30 s混匀，静置10 min。加乙酸乙酯15 ml，涡旋2 min，10 000 r/min离心5 min。取上清液于另一50 ml离心管中，残渣中加乙酸乙酯15 ml，重复提取一次，合并2次提取液，于25℃水浴氮气吹干。
8.2净化
残余物中加0.1 mol/l盐酸溶液5 ml，涡旋1 min充分溶解，加正己烷5 ml，振摇1 min，5 000 r/ min离心5 min，弃正己烷层。下层再加正己烷5 ml重复除脂-次，弃正己烷层，备用。
固相萃取柱依次用甲醇2 ml和0.1 mol/l盐酸溶液2 ml活化，取备用液过柱，依次用0.1 mol/l盐酸溶液2 ml、甲醇1 ml和2%氨水1 ml淋洗，用洗脱液2 ml洗脱。收集洗脱液，35℃水浴氮气吹干，残余物中加水0.5ml涡旋1min，滤膜过滤，供液相色谱-串联质谱测定。
8.3基质匹配标准曲线的制备
取经提取和净化的空白试料溶液，加入适量的混合标准工作液和1μg/ml混合内标工作液10μl，35℃水浴氮气吹干，加水0.5 ml涡旋1 min，配制成浓度为2μg/l、4μg/l、20μg/l、40μg/l、200μg/l和400μg/l的基质匹配标准溶液，过滤后供液相色谱-串联质谱测定。以测得的硝基咪唑类药物与相应内标的特征离子峰面积之比为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。
8.4测定
8. 4.1液相色谱参考条件
a)色谱柱：c18色谱柱(50 mm×2.1 mm，1.7μm)或相当者；
b)流动相：a为0. 1%的甲酸水溶液，b为0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脱程序见表1；
c)流速：0.3 ml/min；
d)柱温：30℃；
e)进样量：10μl。
8.4.2质谱参考条件
a)离子源：电喷雾(esi)离子源；
b)扫描方式：正离子扫描；
c)检测方式：多反应监测；
d)喷雾电压：3 000 v；
e)雾化温度：350℃；
f)源温：100℃；
g)锥孔气流速：30 l/h；
h)雾化气流速：600 l/h；
i)待测药物定性离子对、定量离子对、锥孔电压和碰撞能量的参考值见表2。
8. 4.3测定法
8.4.3. 1定性测定
在同样测试条件下，试料溶液中硝基咪唑类药物的保留时间与基质四配标准工作液中硝基咪唑类药物的保留时间之比，偏差在±2.5%以内，且检测到的相对离子丰度，应当与浓度相当的基质匹配标准溶液离子相对丰度一致。其允许偏差应符合表3要求。
8.4.3.2定量测定
取试料溶液和基质匹配标准工作液，作单点或多点校准，按内标法定量。基质匹配标准工作液及试料溶液中目标物的响应值均应在仪器检测的线性范围内。在上述色谱质谱条件下，标准溶液特征离子质量色谱图见附录b。
8.5空白试验
取空白试料，除不加药物外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。
9结果计算和表述
试样中硝基咪唑类药物的残留量按标准曲线或公式(1)计算。
式中：
x——试样中硝基咪唑类药物残留量的数值，单位为微克每千克(μg/kg)；
a——供试试样溶液中硝基咪唑类药物的峰面积；
a'is——基质匹配标准溶液中内标的峰面积；
cs——基质匹配标准溶液中硝基咪唑类药物浓度的数值，单位为微克每升(μg/l)；
cis——供试试样中内标浓度的数值，单位为微克每升(μg/l)；
v——供试试样最终定容体积的数值，单位为毫升(ml)；
ais——供试试样溶液中内标的峰面积；
as——基质匹配标准溶液中硝基咪唑类药物的峰面积；
c'is——基质匹配标准溶液中内标浓度的数值，单位为微克每升(μg/l)；
m——供试试样质量的数值，单位为克(g)。
10方法灵敏度、准确度和精密度
10.1灵敏度
本方法的检测限为0.5μg/kg，定量限为1μg/kg。
10.2准确度
本方法在1μg/kg~10μg/kg添加浓度水平上的回收率为60%~120%。
10.3精密度
本方法批内相对标准偏差≤20%，批间相对标准偏差≤20%。
德国FESTO电磁阀的结构特点是什么
圆筒式油缸防护罩行程15米一件可以定做吗？
刀尖圆弧在数控车床加工中的影响
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