Hortic Res：NMT结合根系转基因技术快速验证基因功能
nmt作为生命科学底层核心技术，是建立活体创新科研平台的*技术。2005年~2020年，nmt已扎根中国15年。2020年，中国nmt销往瑞士苏黎世大学，正式打开欧洲市场。
基本信息
主题：nmt为磷脂丝胺酸合成酶调控作物耐盐提供直接证据
期刊：horticulture research
研究使用平台：nmt农作物耐盐创新科研平台
标题：overexpression ofphosphatidylserine synthase ibpss1 affords cellular na+ homeostasisand salt tolerance by activating plasma membrane na+/h+ antiportactivity in sweet potato roots
作者：江苏师范大学孙健、李宗芸
检测指标
na+、h+、ca2+
检测样品
甘薯幼苗的转基因根（trs）以及wt和转基因株系的不定根（ars）
离子流实验处理方法
4.1预处理
①200 mm nacl处理24小时，检测trs和ars伸长区（距根尖1.5、2.0、3.0 mm的根表上的点）和成熟区（距根尖10、12、15 mm的根表上的点）na+和h+流速。
②检测wt和转基因株系伸长区和成熟区在200mmnacl处理9d的na+流速。
③检测150mm nacl胁迫wt和转基因系根伸长区（距根尖2mm的根表上的点）的ca2+流速。
④外源血磷脂酰*（lps）预处理的wt，在nacl胁迫48h后，测定根系伸长区na+流速
⑤lps预处理的wt，在nacl处理10min后，测定根伸长区（距根尖1.5、2.5和3mm的根表上的点）ca2+流速。
⑥lps预处理的wt，测定10mm h2o2处理，根伸长区（距根尖1.5、2.5和3mm的根表上的点）ca2+流速。
4.2瞬时处理
①150 mm nacl和10 mm h2o2瞬时处理 trs和ars伸长区（距2 mm的根表上的点）记录ca2+流速。
②10mm h2o2瞬时处理wt和转基因植株根伸长区（距2 mm的根表上的点）记录ca2+流速
k+流ca2+流结果
5.1 ibpss1过表达甘薯根系细胞na+稳态改变
在nacl（200mm）胁迫24h后，ars和trs的所有被测根区（伸长区和成熟区）都显示出明显的na+外排（图1a），而在trs中观察到比ars更明显的na+外排。trs两个根区的平均na+外排速率分别比ars高2.5倍和2.3倍（图1a、b）。相应地，在ars和trs的两个根区记录到明显的h+内流（图1c）。与na+外排相似，trs两个根区的h+内流明显高于ars（图1d）。在没有nacl胁迫的情况下，ars和trs之间没有观察到na+或h+流速的差异（数据未展示）。这些结果表明，ibpss1过表达通过激活pm-na+/h+逆向转运体活性来抑制细胞na+的积累。
图1
5.2 ibpss1在甘薯根中的过表达增强了pm-ca2+通道对nacl和h2o2的敏感性
为了研究ibpss1对盐渍甘薯根系ca2+转运的影响，我们测定了nacl诱导的瞬时ca2+流速。nacl（150mm）在ars的伸长区诱导了一个瞬时且逐渐减少的ca2+外排，在nacl处理20min后恢复到对照水平（图2a）。我们没有观察到盐胁迫下ars中ca2+内流明显增加。然而，nacl诱导trs伸长区的ca2+外排量远低于ars（图2a）。在trs中，我们观察到添加nacl后，从0分钟到10分钟，nacl诱导的ca2+外排逐渐减少，并且在nacl处理10分钟后，ca2+流出明显转变为ca2+内流（图2a）。这些结果清楚地表明ibpss1的过表达增强了甘薯根pm- ca2+通道对nacl胁迫的敏感性。
我们进一步比较了h2o2诱导的ars和trs伸长区的ca2+流速。h2o2（10mm）诱导了ars中ca2+的立即内流。h2o2处理下的平均ca2+内流速率达到23 pmol cm-2 s-1（图2b）。h2o2诱导trs伸长区ca2+内流较ars明显。trs中的平均ca2+内流率达到60 pmol cm-2 s-1（图2b）。这些结果表明，在trs中pm-ca2+通道对h2o2的敏感性也增强。
图2
5.3ibpss1过表达提高转基因甘薯的耐盐性
为了确定ibpss1是否能在整个植株水平上提高耐盐性，三个具有多bpss1转录水平的再生转基因系（l11、l17和l19）被用于进一步的生理特性鉴定。对wt和ibpss1转基因苗进行nacl（200mm）处理9天。结果发现，三个转基因品系盐渍根的伸长区和成熟区的na+净外排量显著高于野生型（图3g）。此外，在ibpss1高表达幼苗的根部，pm-ca2+渗透通道对nacl和h2o2的敏感性增强（图3h，j）。
在nacl（200mm）胁迫48h后，lps预处理的wt根系伸长区na+外排量比未处理的增加了65%（图3c）。此外，由nacl胁迫（150mm；在nacl处理10 min后开始测量ca2+流速；图3d）和h2o2（10 mm；h2o2处理后立即开始测量ca2+流速；图3e）诱导的平均ca2+内流速率在lps预处理的根中比未处理的根增强更多。
图3
其他实验结果
ibpss1参与了磷脂酰*（phosphatidylserine，ps）的合成。
高效甘薯根系转基因体系可以有效地用于确定相关基因在介导甘薯根系na+稳态中的作用。
ibpss1过表达在全株水平上提高了转基因甘薯的耐盐性
结论
ibpss1通过促进根系na+稳态和na+外排来增强甘薯的耐盐性，而后一过程可能是通过ps增强根内ca2+信号来控制的。
离子流实验使用的测试液
0.5 mm nacl，0.1 cacl2，ph 6.0
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④外源血磷脂酰*（lps）预处理的wt，在nacl胁迫48h后，测定根系伸长区na+流速
⑤lps预处理的wt，在nacl处理10min后，测定根伸长区（距根尖1.5、2.5和3mm的根表上的点）ca2+流速。
⑥lps预处理的wt，测定10mm h2o2处理，根伸长区（距根尖1.5、2.5和3mm的根表上的点）ca2+流速。
4.2瞬时处理
①150 mm nacl和10 mm h2o2瞬时处理 trs和ars伸长区（距2 mm的根表上的点）记录ca2+流速。
②10mm h2o2瞬时处理wt和转基因植株根伸长区（距2 mm的根表上的点）记录ca2+流速
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在nacl（200mm）胁迫24h后，ars和trs的所有被测根区（伸长区和成熟区）都显示出明显的na+外排（图1a），而在trs中观察到比ars更明显的na+外排。trs两个根区的平均na+外排速率分别比ars高2.5倍和2.3倍（图1a、b）。相应地，在ars和trs的两个根区记录到明显的h+内流（图1c）。与na+外排相似，trs两个根区的h+内流明显高于ars（图1d）。在没有nacl胁迫的情况下，ars和trs之间没有观察到na+或h+流速的差异（数据未展示）。这些结果表明，ibpss1过表达通过激活pm-na+/h+逆向转运体活性来抑制细胞na+的积累。
图1
5.2 ibpss1在甘薯根中的过表达增强了pm-ca2+通道对nacl和h2o2的敏感性
为了研究ibpss1对盐渍甘薯根系ca2+转运的影响，我们测定了nacl诱导的瞬时ca2+流速。nacl（150mm）在ars的伸长区诱导了一个瞬时且逐渐减少的ca2+外排，在nacl处理20min后恢复到对照水平（图2a）。我们没有观察到盐胁迫下ars中ca2+内流明显增加。然而，nacl诱导trs伸长区的ca2+外排量远低于ars（图2a）。在trs中，我们观察到添加nacl后，从0分钟到10分钟，nacl诱导的ca2+外排逐渐减少，并且在nacl处理10分钟后，ca2+流出明显转变为ca2+内流（图2a）。这些结果清楚地表明ibpss1的过表达增强了甘薯根pm- ca2+通道对nacl胁迫的敏感性。
我们进一步比较了h2o2诱导的ars和trs伸长区的ca2+流速。h2o2（10mm）诱导了ars中ca2+的立即内流。h2o2处理下的平均ca2+内流速率达到23 pmol cm-2 s-1（图2b）。h2o2诱导trs伸长区ca2+内流较ars明显。trs中的平均ca2+内流率达到60 pmol cm-2 s-1（图2b）。这些结果表明，在trs中pm-ca2+通道对h2o2的敏感性也增强。
图2
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在nacl（200mm）胁迫48h后，lps预处理的wt根系伸长区na+外排量比未处理的增加了65%（图3c）。此外，由nacl胁迫（150mm；在nacl处理10 min后开始测量ca2+流速；图3d）和h2o2（10 mm；h2o2处理后立即开始测量ca2+流速；图3e）诱导的平均ca2+内流速率在lps预处理的根中比未处理的根增强更多。
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