如何处理PCR反应中的污染？

pcr反应的特点是具有较大扩增能力与灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。那么我们该如何处理pcr反应中的污染呢？让我们一起来看看吧！
一、环境污染
1.稀酸处理法：对可疑器具用1mol/l盐酸擦拭或浸泡，使残余dna脱嘌呤。
2.紫外照射（uv）法：紫外波长（nm）一般选择254/300nm,照射30min即可。需要注意的是，选择uv作为消除残留pcr产物污染时，要考虑pcr产物的长度与产物序列中碱基的分布，uv照射仅对500bp以上长片段有效，对短片段效果不大。uv照射时，pcr产物中嘧啶碱基会形成二聚体，这些二聚体可使延伸终止，但并不是dna链中所有嘧啶均能形成二聚体，且uv照射还可使二聚体断裂。形成二聚体的程度取决于uv波长，嘧啶二聚体的类型及与二聚体位点相邻核苷酸的序列。
在受照射的长dna链上，形成二聚体缺陷的数量少于0.065/碱基，其他非二聚体的光照损伤（如环丁烷型嘧啶复合体，胸腺嘧啶乙二醇，dna链间与链内的交联和dna断裂等）均可终止taq dna聚合酶的延伸。这些位点的数量与二聚体位点相当。如果这些位点（0.13/碱基）在dna分子上随机分布，一个500bp片段的dna分子链上将有32处损伤位点，那么，105个这样的分子中每个分子中会至少有一处损伤。相反，如果100bp的片段，每条链上仅有6处损伤，105个拷贝分子中将有许多分子没有任何损伤。这就是uv照射有一定的片段长度限制的原因。
二、反应液污染
1.dnase i法：pcr混合液（未加模板和taq聚合酶）加入0.5u dnase i,室温反应30 min后加热灭活，然后加入模板和taq聚合酶进行正常pcr扩增。该方法的优点是不需要知道污染dna的序列。
2.内切酶法：选择识别4个碱基的内切酶（如msp i和taq i等），可同时选择几种，以克服用一种酶只能识别特定序列的缺陷，室温作用1h 后加热灭活进行pcr。
3.紫外照射法：未加模板和taq聚合酶的pcr混合液进行紫外照射，注意事项与方法同上述uv照射法。
4.g射线辐射法：1.5kgy的辐射可wan全破坏0.1ng基因组dna,2.0 kgy可破坏104拷贝的质粒分子，4.0 kgy仍不影响pcr,但高于此限度会使pcr扩增效率下降。引物可受照射而不影响pcr,g射线是通过水的离子化产生自由基来破坏dna的。
三、rs-pcr法（rna-specific pcr）
也称为链特异性pcr,主要指用于rna模板的特异性pcr法，该法可明显降低假阳性而不影响pcr的敏感性。其关键在于设计引物，逆转录引物的3ˊ端(a区)有2 0个核苷酸左右为模板的特异性互不序列，5ˊ端2 0个核苷酸(c区)为附加修饰碱基。与mrna逆转录后，经超速离心使 cdna与多余引物分开，再用和第二引物(c)以第一链cdna为模板合成第二链cdna,以后的pcr循环中用逆转录引物的b区和引物c进行扩增加尾cdna,而污染的dna或质粒dna才不会被扩增。
四、抗污染引物法
该对引物扩增时通过病毒dna克隆如入质粒的位点。这一区域只存在完整的原病毒中，在重组质粒中，这一区域分成两个区域与克隆位点被。如果重组质粒污染了标本，也不能扩增出任何条带，即使出现了扩增带，其大小也与预期的不同。只有原病毒dna才能被引物扩增，因此只要出现预期大小的扩增带就可以证明标本是阳性的，该法试用于环状靶分子系列。
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