小鼠白细胞介素10试剂盒的操作方法
白介素10是一种多细胞源、多功能的细胞因子 ,调节细胞的生长与分化,参与炎性反应和免疫反应,是目前炎症与免疫抑制因子。在肿瘤、感染、造血系统及心血管系统中发挥重要作用 ,与血液、消化、尤其是心血管系统疾病密切相关。
在1989年,mosmannand及他们的同事描述了一种新的免疫介质,由th2细胞克隆分泌,能够抑制th1细胞克隆il-2和ifnr的合成。早期被命名为细胞因子合成抑制因子(csif),这种因子后来被命名为il-10,在这被发现的21年期间,很多研究深入剖析了这个细胞因子的生物学特性。
细胞的来源:
目前已知并非只有特定的t细胞亚群才能合成il-10,几乎所有淋巴细胞均能合成il-10。体内最重要的来源主要是单核巨噬细胞和t辅助细胞,此外,树突状细胞,b细胞,细胞毒性t细胞,γδt细胞,nk细胞,肥大细胞以及中性粒细胞和嗜酸性细胞也能合成il-10,这些细胞分泌il-10主要决定于特定的刺激,受损组织类型和某种免疫反应时间点。
单核巨噬细胞在各种内源性和外源性介质的作用下激活后分泌il-10,如lps(通过激活tlr4,traf3,nf-κbp65/p50,和erk激酶)、儿茶酚胺(通过激活蛋白激酶a和creb-1/atf-1)引起il-10基因转录。单核巨噬细胞在清除凋亡细胞过程中也会分泌il-10,这一过程依赖于cd36和p38丝裂原激活蛋白(map)激酶,除了转录水平,等最近认为il-10也被microrna在转录后期所调节。
操作步骤:
1. 标准品的稀释:本试剂盒提供原倍标准品一支,用户可按照下列图表在小试管中进行稀
释。
1000pg/ml 5 号标准品150μl 的原倍标准品加入150μl 标准品稀释液
500pg/ml 4 号标准品150μl 的5 号标准品加入150μl 标准品稀释液
250pg/ml 3 号标准品150μl 的4 号标准品加入150μl 标准品稀释液
125pg/ml 2 号标准品150μl 的3 号标准品加入150μl 标准品稀释液
62.5pg/ml 1 号标准品150μl 的2 号标准品加入150μl 标准品稀释液
2. 加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、标准孔、待
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3
测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl,待测样品孔中先加样品稀释液40μl, 然
后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5 倍)。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不
触及孔壁,轻轻晃动混匀。
3. 温育:用封板膜封板后置37℃温育30 分钟。
4. 配液:将30 倍浓缩洗涤液用蒸馏水30 倍稀释后备用
5. 洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30 秒后弃去,如此
重复5 次,拍干。
6. 加酶:每孔加入酶标试剂50μl,空白孔除外。
7. 温育:操作同3。
8. 洗涤:操作同5。
9. 显色:每孔先加入显色剂a50μl,再加入显色剂b50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色
15 分钟.
10. 终止:每孔加终止液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。
11. 测定:以空白空调零,450nm 波长依序测量各孔的吸光度(od 值)。测定应在加终止液
后15 分钟以内进行。
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