海藻及海洋细菌的DNA制备方法
众suo周知，海藻由于富含多糖，dna提取是一大难题，以下是在试验过程中收集的海藻dna制备方法，经试验验证可行，现在贴出来，以觞众战友。
一、可大量培养的海洋细菌
1、取1ml目的菌菌液至1.5ml的ep管中，5000r/m离心5分钟弃上清，菌体加入500μl水洗涤一次，5000r/m离心5分钟，弃上清，向菌体中加入200μl悬浮缓冲液。
2、在200μl悬浮缓冲液中加人55℃tirs饱和酚200μl和10%的sds 45μl混匀，在微型蜗旋混和仪上混匀，55℃温浴15分钟，并且不断振荡混匀。
3、12000r/m离心5分钟，取上层水相移至新的ep管中。
4、加入等量的lv仿/异戊醇抽提，12000r/m离心5分钟，转移上层水相至新管，反复抽提至界面澄清。
5、取上层水相加入0.1倍的3m醋酸钠和2.5倍体积的无水乙醇混匀于-20℃放置2h沉淀dna。
6、12000r/m离心20分钟，沉淀dna弃上清，用预冷的的70%的乙醇洗2次，在室温下晾干，加入40μl无菌水溶解，-20℃保存。
本方法用于海洋假单孢菌、以及部分兰细菌（蓝藻）可行。
二、从海水中制备细菌/浮游生物的混合dna
海洋浮游生物生物量较小，往往需要采集大量的海水样本，过滤收集特定粒径的浮游生物。这里介绍的是一种简单、快速、实用的符合环境指示基因pcr扩增需要的浮游生物模板dna制备方法。
1、取40 μl水样，与等体积0.25 mol/l naoh混合，并于25 ℃温育过夜。
2、99 ℃加热10 min，冷却至室温，简单离心收集溶液，依次加入8 μl 1 mol/l hcl，20 μl 0.5 mol/l tris-hcl（ph 8.0）和10 μl 2% （v/v，体积分数）triton x-100，混合并离心。
3、将混合溶液再次在99 ℃加热10 min。
4、制备的模板dna溶液ph值 在8到9之间，可直接用于pcr扩增反应，不需要其它纯化处理。
本方法用于海洋弧菌可行。
三、褐藻
approximately 500mg of fresh leaves were ground in liquid nitrogen, transferred to the lysis buffer (1.5% ctab, 75mm tris-hcl, 1.5mm edta, 1.0m nacl, 0.5mg/ml rnase a), and incubated for 30 min at 65℃. proteinase k (final concentration of 10 mg/ml) was added and incubation continued for 30 min at 37℃. an equal volume of phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1) was added, mixed and the sample centrifuged at 2,300g for 20 min. approximately 500μl of upper aqueous layer was transferred to a new tube and 50μl of 10% ctab (10% ctab, 0.7 m nacl), an equal volume of phenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1) was added, mixed and the sample centrifuged at 2,300g for 20 min. the upper aqueous layer was transferred to a new tube and an equal volume of 1% ctab (10% ctab, 50mm tris-hcl, 10mm edta) was added, mixed and the sample centrifuged at 1,000g for 10 min. the dna was precipitated. the dna was washed with 70% ethanol. then the dna pellet was air-dried and redissolved in te (tris-edta) buffer.
本方法用于鼠尾藻，可行。
四、红藻
1、取1g藻体，用蒸馏水洗净，加入大约2ml提取缓冲液[4% sds, 0.05 m tris. hcl，ph8.0, 0.1m edta, 0.2mnacl]， 在0℃冰浴中充分研磨后，加蛋白酶k(终浓度100ug/ml)，在50℃水浴 间断震荡3.5-4小时。
2、15,000 rpm离心10min，取上清液，加等体积的酚抽提, 15,000rpm离心10min。
3、取上清液，再以酚/lv仿/异戊醇(25:24:1)及lv仿抽提，15,000rpm离心10min。
4、取上清液，加入二倍体积的无水乙醇使dna沉淀，离心，用70%的乙醇洗沉淀两次。
5、干燥后，溶解在50ul无菌te(10mmtris, 0.1mm edta,ph8.0)中，-20℃储存备用。
本方法用于紫菜孢子体、紫菜配子体、江蓠、龙须菜可行。
五、甲藻
1、取对数生长期的培养物，在 4 ℃下用 冷冻离心机6000 rpm离心 6 min，收集藻细胞。
2、收集的藻细胞放于液氮中冷冻半个小时后，在研钵中研磨成粉末，转移到 1.5ml 的灭菌离心管中，加入总体积 700μl 裂解缓冲液(100mm edta, ph 8.0；10 mm tris-hcl, ph 8.0；1% sds；200 μg/ml protease k)放于55 ℃温浴 3 h，其间不时摇动。
3、待溶液澄清透亮裂解*后，用一倍体积的平衡酚抽提一次, 吸取上清转移至另一灭菌管中; 上清用一倍体积的平衡酚：lv仿（25:24）抽提一次，吸取上清移至另一灭菌管中；上清再用一倍体积的平衡酚：lv仿：异戊醇（25:24:1）抽提一次，吸取收集上清；收集的上清液加入十分之一体积 3 m 醋酸纳和两倍体积冰预冷的无水乙醇，-20 ℃过夜放置。
4、第二天12000 rpm离心20min后弃去上清，dna 沉淀用 70%的乙醇洗涤两次，晾干。
5、最终溶解于 50 μlte 缓冲液 (10 mm tris-hcl ph 8.0；1 mm edta)。
本方法用于塔玛亚历山大藻、原甲藻可行。
六、蓝藻（以前在reply过，现在集中到这里）
solution i： 100 mm nacl, 30 mm tris.cl （ph 7.8）, 10 mm edta
solution ii：0.1 m nacl，0.2 m蔗糖，10 mm edta
裂解液： 0.25 mm edta, 0.5 m tris.cl, （ph 9.2），2.5% sds，10 mm ?-巯基乙醇
tae： 40 mm tris-acetate, 1 mm edta
te： 20 mmol/l tris. cl (8.0), 1 mmol/l edta (8.0)
1、称取1 g干藻粉置于eppendorf 管中；
2、加入0.5 ml solution i，振荡1 min；
3、 10,000 rpm离心1 min，弃上清；
4、重新加入0.5 ml solution i洗涤，收集沉淀；
5、用0.6 ml solution ii悬浮沉淀后，加入0.2 ml 裂解液，剧烈振荡1 min；
6、55 ?c水浴1 h；
7、加入等体积的酚/lv仿/异戊醇抽提两次（10,000 rpm, 8 min）；
8、用等体积的lv仿/异戊醇（10,000 rpm, 8 min）抽提1次后收集上清；
9、 加入1/10体积的3 m naac（ph 5.2）和2倍体积的无水乙醇；
10、室温沉淀20 min, 10,000 rpm离心8 min；
11、70 %乙醇洗涤沉淀除盐两次并吹干；
12、50 ?l ddh2o溶解沉淀；
13、 加入rnasea去rna，电泳检测后- 20 ?c保存备用。
本方法用于螺旋藻、节旋藻可行。
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2、在200μl悬浮缓冲液中加人55℃tirs饱和酚200μl和10%的sds 45μl混匀，在微型蜗旋混和仪上混匀，55℃温浴15分钟，并且不断振荡混匀。
3、12000r/m离心5分钟，取上层水相移至新的ep管中。
4、加入等量的lv仿/异戊醇抽提，12000r/m离心5分钟，转移上层水相至新管，反复抽提至界面澄清。
5、取上层水相加入0.1倍的3m醋酸钠和2.5倍体积的无水乙醇混匀于-20℃放置2h沉淀dna。
6、12000r/m离心20分钟，沉淀dna弃上清，用预冷的的70%的乙醇洗2次，在室温下晾干，加入40μl无菌水溶解，-20℃保存。
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1、取40 μl水样，与等体积0.25 mol/l naoh混合，并于25 ℃温育过夜。
2、99 ℃加热10 min，冷却至室温，简单离心收集溶液，依次加入8 μl 1 mol/l hcl，20 μl 0.5 mol/l tris-hcl（ph 8.0）和10 μl 2% （v/v，体积分数）triton x-100，混合并离心。
3、将混合溶液再次在99 ℃加热10 min。
4、制备的模板dna溶液ph值 在8到9之间，可直接用于pcr扩增反应，不需要其它纯化处理。
本方法用于海洋弧菌可行。
三、褐藻
approximately 500mg of fresh leaves were ground in liquid nitrogen, transferred to the lysis buffer (1.5% ctab, 75mm tris-hcl, 1.5mm edta, 1.0m nacl, 0.5mg/ml rnase a), and incubated for 30 min at 65℃. proteinase k (final concentration of 10 mg/ml) was added and incubation continued for 30 min at 37℃. an equal volume of phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1) was added, mixed and the sample centrifuged at 2,300g for 20 min. approximately 500μl of upper aqueous layer was transferred to a new tube and 50μl of 10% ctab (10% ctab, 0.7 m nacl), an equal volume of phenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1) was added, mixed and the sample centrifuged at 2,300g for 20 min. the upper aqueous layer was transferred to a new tube and an equal volume of 1% ctab (10% ctab, 50mm tris-hcl, 10mm edta) was added, mixed and the sample centrifuged at 1,000g for 10 min. the dna was precipitated. the dna was washed with 70% ethanol. then the dna pellet was air-dried and redissolved in te (tris-edta) buffer.
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四、红藻
1、取1g藻体，用蒸馏水洗净，加入大约2ml提取缓冲液[4% sds, 0.05 m tris. hcl，ph8.0, 0.1m edta, 0.2mnacl]， 在0℃冰浴中充分研磨后，加蛋白酶k(终浓度100ug/ml)，在50℃水浴 间断震荡3.5-4小时。
2、15,000 rpm离心10min，取上清液，加等体积的酚抽提, 15,000rpm离心10min。
3、取上清液，再以酚/lv仿/异戊醇(25:24:1)及lv仿抽提，15,000rpm离心10min。
4、取上清液，加入二倍体积的无水乙醇使dna沉淀，离心，用70%的乙醇洗沉淀两次。
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4、第二天12000 rpm离心20min后弃去上清，dna 沉淀用 70%的乙醇洗涤两次，晾干。
5、最终溶解于 50 μlte 缓冲液 (10 mm tris-hcl ph 8.0；1 mm edta)。
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solution ii：0.1 m nacl，0.2 m蔗糖，10 mm edta
裂解液： 0.25 mm edta, 0.5 m tris.cl, （ph 9.2），2.5% sds，10 mm ?-巯基乙醇
tae： 40 mm tris-acetate, 1 mm edta
te： 20 mmol/l tris. cl (8.0), 1 mmol/l edta (8.0)
1、称取1 g干藻粉置于eppendorf 管中；
2、加入0.5 ml solution i，振荡1 min；
3、 10,000 rpm离心1 min，弃上清；
4、重新加入0.5 ml solution i洗涤，收集沉淀；
5、用0.6 ml solution ii悬浮沉淀后，加入0.2 ml 裂解液，剧烈振荡1 min；
6、55 ?c水浴1 h；
7、加入等体积的酚/lv仿/异戊醇抽提两次（10,000 rpm, 8 min）；
8、用等体积的lv仿/异戊醇（10,000 rpm, 8 min）抽提1次后收集上清；
9、 加入1/10体积的3 m naac（ph 5.2）和2倍体积的无水乙醇；
10、室温沉淀20 min, 10,000 rpm离心8 min；
11、70 %乙醇洗涤沉淀除盐两次并吹干；
12、50 ?l ddh2o溶解沉淀；
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